《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Establishment of PEG-mediated protoplast transformation in
Stagonospora tainanensis and GFP visualization of direct penetration in sugarcane leaves
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摘要由Stagonospora tainanensis引起的甘蔗叶枯病是甘蔗的重要病害。然而，该病原体的致病机制至今仍不十分清楚。为建立该真菌的基因转化系统，我们优化了菌丝细胞壁降解与原生质体再生的条件，最终形成了高效的Stagonospora tainanensis原生质体制备
摘要
由Stagonospora tainanensis引起的甘蔗叶枯病是甘蔗的重要病害。然而，该病原体的致病机制至今仍不十分清楚。为建立该真菌的基因转化系统，我们优化了菌丝细胞壁降解与原生质体再生的条件，最终形成了高效的Stagonospora tainanensis原生质体制备方案，每克菌丝可产生3.21×109个原生质体，原生质体再生率为37.43%。为评估这些原生质体用于基因转化的可行性，我们通过PEG介导的转化方法，将携带基因及潮霉素B筛选标记的质粒导入Stagonospora tainanensis原生质体中，成功获得了能表达绿色荧光蛋白的稳定、耐潮霉素的转化子。将带有GFP标签的转化子接种到甘蔗叶片后，可见在接种后4小时孢子开始萌发，12小时形成菌丝，36小时出现明显的感染灶。48小时时菌丝顶端在细胞间隙变粗，72小时时大量菌丝聚集在病斑处，96小时时菌丝形成复杂的网状结构并在叶片表皮细胞间蔓延。这一基因转化系统的建立为进一步研究甘蔗叶枯病的致病机制以及筛选抗Stagonospora tainanensis的甘蔗种质提供了重要工具。
引言
甘蔗（Saccharum属）是禾本科单子叶C4作物，是全球重要的糖料作物，在热带和亚热带地区广泛种植。甘蔗的驯化使糖从稀有奢侈品变成了全球性商品，改变了全世界的饮食结构和经济状况[1]。在许多发展中国家，甘蔗产业是重要的经济支柱，有助于减少贫困和改善民生[2]。在中国，甘蔗提供的蔗糖占全国总糖消费量的90%以上[3]。然而，甘蔗病害的发生率正在以惊人的速度上升，导致产量大幅下降和每年巨大的经济损失[4]。中国境内的甘蔗病害主要包括真菌病、细菌病和病毒病，其中主要的真菌病有黑粉病、褐斑病、锈病、白斑病、红腐病、棕斑病、环斑病以及叶枯病。其中，由真菌病原体Stagonospora tainanensis（有性态：Leptosphaeria taiwanensis）引起的甘蔗叶枯病是一种严重的真菌病害，会导致叶片出现枯斑症状并加速叶片衰老[5]、[6]。该病于1976年首次在中国台湾地区爆发，影响了超过1万公顷的甘蔗种植面积[7]。根据我们在广西壮族自治区扶绥县的田间调查，易感品种的产量损失可达20-30%[5]。近年来，甘蔗叶枯病在中国广西、云南、广东和福建等主要甘蔗种植区普遍发生，造成了严重的产量损失[8]。
基因转化是研究真菌致病性的重要工具。常见的方法包括PEG介导的原生质体转化[9]、[10]、Agrobacterium tumefaciens介导的转化[11]、[12]、粒子轰击法[13]、电穿孔法[14]、限制性内切酶介导的整合[15]等。作为目前成熟且有效的真菌表观遗传操作方法，PEG介导的原生质体转化具有周期短、操作简单且重复性高的优点[16]。目前许多丝状真菌都已建立了高效的原生质体转化系统，包括Magnaporthe oryzae[17]、Fusarium oxysporum[18]、Colletotrichum acutatum[19]以及Botrytis cinerea[20]等。PEG介导的原生质体转化能否成功取决于两个关键步骤：原生质体的制备与再生。其中影响转化效果的关键因素包括真菌材料的年龄、所使用的溶菌酶类型、酶解时间以及渗透稳定剂的种类[21]、[22]。本研究旨在为Stagonospora tainanensis建立高效稳定的PEG介导基因转化系统，以便开展分子生物学研究。
通过研究病原体的侵染过程，研究人员可以深入理解病原体与宿主之间的相互作用，系统地掌握疾病流行的规律，为精准防控疾病和培育抗病品种提供理论依据。但由于在显微镜下难以观察特定感染部位和时期的病原体，直接研究侵染过程仍然面临很大挑战[23]、[24]。绿色荧光蛋白（GFP）是一种常见的报告基因，由238个氨基酸组成，在荧光显微镜下可发出稳定的绿色荧光[25]、[26]、[27]、[28]。在丝状真菌中，可通过PEG介导的原生质体转化将基因整合到基因组中，这种方法能够增加细胞膜的通透性，便于外源DNA的进入和染色体整合，从而构建出带有GFP标记的菌株[29]。由于GFP具有稳定性高、易于观察且适用范围广等优点，基于GFP的标记技术已成为追踪侵染过程最有效的细胞学工具之一[30]、[31]。该方法已被成功应用于多种丝状真菌的侵染过程研究，包括Aspergillus carbonarius、Stagonospora nodorum、Magnaporthe oryzae以及Leptosphaeria biglobosa[32]、[33]、[34]、[35]。尽管甘蔗叶枯病是一种重要的叶部病害，但其病原体Stagonospora tainanensis的致病机制仍大部分未被揭示。因此，有必要构建带有GFP标记的菌株，以便在宿主体内观察Stagonospora tainanensis的动态，明确其侵染和致病过程。
本研究首次报道了针对Stagonospora tainanensis建立的PEG介导基因转化系统。通过系统优化原生质体制备与再生的条件，我们得到了高效且具有物种特异性的转化方案。利用该系统，我们获得了能够稳定表达GFP的转化子，从而首次实现了对Stagonospora tainanensis在甘蔗叶片上完整侵染过程的可视化观察。研究结果表明，该真菌可直接穿透叶片表皮，无需依赖气孔或伤口侵入。因此，这项研究为功能基因组学研究提供了重要工具，也为深入理解甘蔗叶枯病的致病机制带来了新的见解。
内容节选
测试菌株与培养条件
Stagonospora tainanensis的菌种保存液保存在广西甘蔗生物学重点实验室，置于4°C条件下并添加20%甘油。这些病原体在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，购自中国青岛的Hope Bio-Technology Co., Ltd）上培养，培养温度为25°C，且在完全黑暗的环境中进行。
原生质体的制备
将幼嫩的菌丝放入100毫升的马铃薯葡萄糖肉汤（PDB，同样来自Hope Bio-Technology Co., Ltd）中，于25°C、150转/分钟的条件下培养18小时，之后用无菌双层纱布过滤，收集所得菌丝。
不同酶类及其组合对原生质体释放的影响
在25°C、90转/分钟条件下酶解1.5小时后，1%蜗牛酶+1%德里塞拉酶+1%溶菌酶的组合产生的原生质体数量最多，为70.63×106个原生质体/毫升，其次是1%蜗牛酶+1%德里塞拉酶的组合。单独使用溶菌酶或蜗牛酶时，产生的原生质体数量明显较少。（见图1A）。
酶解时间对原生质体产量的影响
在1%蜗牛酶+1%德里塞拉酶+1%溶菌酶的组合条件下，于25°C、90转/分钟条件下培养时，释放出的原生质体数量会逐渐增加。
讨论
在PEG介导的基因转化过程中，原生质体的数量与质量是决定转化效率的关键因素。初步实验表明，Stagonospora tainanensis SF007的孢子在摇瓶培养过程中容易聚集，因此本研究选用摇瓶培养得到的幼嫩菌丝作为制备原生质体的材料。酶的组成对原生质体的释放有显著影响，例如在Rhizoctonia solani中，原生质体的释放情况则有所不同。
结论
本研究成功建立了稳定的原生质体制备系统，每克菌丝可产生3.21×109个原生质体，其再生率为37.43%。将带有GFP标记的菌株接种到甘蔗叶片后，可见孢子萌发后病原体会在侵染部位开始定植，随后侵入叶片并导致叶片出现严重黄化现象，而在接种后9天时可在叶片上观察到成熟的分生孢子器。这一转化系统为研究病原体的致病基因以及筛选抗Stagonospora tainanensis的甘蔗品系提供了有力工具。
作者贡献说明
石倩：方法学研究、实验实施。何文亮：实验实施、数据分析。 黄振新：初稿撰写、数据可视化、方法学研究、实验实施、数据分析、概念设计。 孟佳荣：论文修订、研究指导、资源协调、项目管理、资金申请、概念设计。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本研究结果的利益冲突。
数据可用性声明
数据可用性说明：本研究生成的所有数据，如需获取，可向相应作者提出合理请求后获得。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何已知的、可能影响本文研究结果的财务利益关联或个人关系。
致谢
本研究部分得到了广西自然科学基金（编号：2024GXNSFAA010041）、广西科技基地与人才专项项目（编号：Guike AD25069107）以及广西科技重大专项（编号：Guike AA22117004）的资助。作者衷心感谢广西大学的陈宝山教授在整个研究过程以及论文撰写过程中给予的宝贵指导。
Zhenxin Huang|Qian Shi|Wenliang He|Jiaorong Meng
广西大学农学院，广西甘蔗生物学重点实验室，中国南宁530004
