希腊结节性硬化症复杂症患者队列中TSC1和TSC2变异的分子特征研究

《HUMAN MUTATION》：Molecular Characterization of TSC1 and TSC2 Variants in a Greek Cohort of Tuberous Sclerosis Complex Patients

　　

结节性硬化症复合体（TSC）是一种常染色体显性多系统遗传性疾病，由TSC1或TSC2基因的致病性变异引起，导致mTOR信号通路失调并继而形成错构瘤。尽管TSC的遗传基础已明确，但关于TSC1和TSC2变异的群体特异性数据仍在不断积累。本研究旨在表征来自希腊的34例无血缘关系先证者队列中TSC1和TSC2基因的变异谱，其中26例具有明确的TSC诊断，8例为可能的TSC诊断。研究人员采用靶向二代测序（NGS）分析TSC1和TSC2的所有编码外显子及侧翼外显子-内含子边界区域，并通过Sanger测序对鉴定出的变异进行验证。在34例先证者中，22例鉴定出致病性或可能致病性变异，采用本研究的检测策略总体诊断率为65%。其中，32%（7/22）的变异位于TSC1基因，68%（15/22）位于TSC2基因；7个变异（7/22；32%）为既往未报道过的新变异。符合明确临床TSC诊断标准的患者分子检出率为77%（20/26），而可能TSC诊断组为25%（2/8）。探索性基因型-表型分析显示，携带TSC2变异的患者临床表型趋于更严重。这些发现扩展了TSC已知的分子图谱，并支持基因检测在诊断、遗传咨询和患者管理中的临床应用价值。

**论文解读：希腊结节性硬化症患者队列中TSC1和TSC2变异的分子特征研究**

**一、研究背景与目的**

结节性硬化症复合体（TSC）是一种罕见的常染色体显性遗传疾病，以显著的临床异质性为特征，可在脑、皮肤、心脏、肝脏、肾脏、肺和眼等多个器官系统形成多种良性错构瘤。然而，由于临床特征谱广泛，没有任何单一特征是诊断该病的特异性标志。在分子水平上，TSC由TSC1基因（位于9q34）或TSC2基因（位于16p13.3）的致病性变异引起，这两个基因分别编码错构瘤蛋白（hamartin）和马铃薯球蛋白（tuberin）。这两种蛋白与TBC1D7结合形成多聚复合物，作为mTORC1通路的关键负调控因子，调控翻译、自噬、核糖体及大分子生物合成、新生血管形成等多种细胞过程。TSC1或TSC2任一基因功能缺陷导致细胞生长和增殖调控失常，表现为TSC表型。尽管TSC的分子机制研究已取得重大进展，但关于东南欧人群（特别是希腊）中TSC1和TSC2变异谱的综合数据仍然有限。此外，尽管已有基因型-表型关联的报道，但其临床意义仍需不断完善。因此，本研究旨在利用二代测序（NGS）技术表征希腊TSC患者队列中TSC1和TSC2变异的分子谱，鉴定既往未报道的新变异，并探索潜在的基因型-表型关联。

**二、主要技术方法**

研究人员从希腊34例无血缘关系先证者（26例明确TSC诊断，8例可能TSC诊断）的外周血中提取基因组DNA，采用靶向NGS（Illumina MiSeq平台，TruSight Cancer Panel，包含94个癌症相关基因探针）覆盖TSC1和TSC2所有编码外显子及侧翼±20 bp内含子区域，平均测序深度达182×，最小碱基覆盖度50×，最小扩增子覆盖度100×。变异通过Sanger测序在先证者及可用父母中验证。所有变异均按照美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会（ACMG/AMP）指南进行解读，并利用LOVD、ClinVar、gnomAD、PolyPhen-2、SIFT、MutationTaster、MaxEntScan、dbscSNV及I-TASSER等工具进行计算机预测分析。统计比较采用Fisher精确检验，显著性阈值设定为p<0.05。

**三、研究结果**

**3.1 患者特征**：最终队列包含16例女性（47%）和18例男性（53%）。临床诊断年龄分布：38%（13/34）成年期诊断，32%（11/34）儿童期，24%（8/34）婴儿期，6%（2/34）青春期。26例（76%）符合明确临床诊断标准，8例（24%）为可能TSC诊断。最常见的临床表现（患病率>50%）包括低黑色素斑（HM）和皮质发育不良（CD）（各62%），其次为室管膜下结节（SEN）和婴儿痉挛（IS）（各56%）。

**3.2 变异致病性表征**：在34例先证者中，共鉴定出22个致病性或可能致病性变异，其中7个（32%）为未报道过的新变异。变异分布：TSC1基因7个（32%），TSC2基因15个（68%），TSC2基因变异频率显著高于TSC1（p=0.0337）。变异类型包括无义突变、移码突变、剪接位点变异、错义突变和缺失等。在8个家族性病例中，仅1个家系（1/8）有超过2名受累成员携带TSC1致病性变异。35%（12/34）的先证者未检出致病性变异。

**3.3 额外变异表征**：初始筛查共发现63个额外变异，分为两组：PVI组（19例先证者，35个变异与TSC致病性变异共存）和NPVI组（12例先证者，28个变异在缺乏主要分子诊断的患者中发现）。其中PVI组有4个新变异，17个变异为两组共有。

**3.4 意义不明确变异的致病性评估**：通过计算机分析评估了VUS的临床意义。TSC1 c.2302C>T p.(Arg768Cys)变异（患者7）被分类为可能致病性，支持证据包括：gnomAD中极罕见（GAF 2.48×10??）、位于TSC1-TSC2-TBC1D7复合体形成的卷曲螺旋结构域、与家系中轻度表型共分离，以及多种计算机预测工具支持有害影响（PolyPhen-2 0.987，SIFT 0.01）。I-TASSER建模预测该区域为α-螺旋结构，归一化B因子-0.39表明高结构刚性，残基768为埋藏残基，其侧链体积减少可能破坏TSC1同源二聚体的结构完整性。TSC2 c.3083_3091del p.(Asp1028_Met1030del)变异（患者24）被分类为可能致病性，支持证据包括其缺乏人群数据库记录、非重复区域框内缺失、高进化保守性（phyloP100=9.92）及与疾病表型共分离。另有4个变异被分类为VUS。

**3.5 基因型-表型关联**：PVI组HM频率显著高于NPVI组（77% vs. 31%；p=0.0248），而LAM在PVI组未观察到（0% vs. 33%；p=0.0107）。TSC2组肾血管肌脂肪瘤（AML）患病率显著高于TSC1组（60% vs. 0%；p=0.0167），SEN、IS和SEGA在TSC2组也呈较高趋势（但未达统计学显著性），而CD患病率两组相似（71% vs. 67%）。满足明确诊断标准的患者中CD、SEN、HM和面部血管纤维瘤（AF）的患病率显著高于可能诊断组。家族性与新发变异病例之间未发现统计学显著差异。

**3.6 未检出致病变异的先证者**：12例（35%）NPVI患者中，6例符合明确TSC诊断标准（5例散发，1例家族性），6例为可能TSC诊断。部分可能病例（4例）表现为散发肺淋巴管肌瘤病（S-LAM）或临床表型模拟。NPVI可能归因于临床表型模拟、测序覆盖范围限制（仅覆盖外显子及±20 bp内含子）以及低水平体细胞嵌合体。

**四、研究局限性与结论**

本研究存在以下局限性：检测方法的分析检测限约为10%变异等位基因频率（VAF），无法排除低水平嵌合体；队列规模相对较小，限制统计效力；多重比较可能增加I型错误；未系统进行拷贝数变异（CNV）分析和多重连接探针扩增（MLPA）检测；未进行功能验证实验。

**研究结论**：在希腊TSC患者队列中，TSC1和TSC2基因的遗传分析显示TSC2致病性变异占主导地位（68%），且在符合明确临床诊断标准的患者中诊断率显著更高（77%）。鉴定出7个新致病性或可能致病性变异，扩展了TSC的等位基因异质性知识。研究确认新发致病性变异主要影响TSC2基因，而家族性病例在TSC1和TSC2之间分布均衡。未鉴定出致病变异患者比例相对较高，强调在未解决病例中考虑嵌合体和非编码致病性改变的重要性。最终，希腊TSC先证者的分子特征强化了局部基因型-表型关联，为早期临床干预、个性化遗传咨询以及靶向mTOR抑制剂治疗的潜在实施提供了重要框架。该论文发表于《HUMAN MUTATION》。