《Phytomedicine》：Pulsatilla saponin D Triggers SHP
2-Mediated Mitochondrial Dysfunction and Ferroptosis to Augment Cancer Immunotherapy
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摘要背景尽管免疫检查点疗法为癌症治疗带来了革命性变革，但其疗效仍有限，主要原因在于存在非免疫原性和免疫抑制性的微环境。寻找天然来源的、能够诱导免疫原性细胞死亡的小分子物质，是克服这一治疗障碍的有效策略。目的本研究旨在发现天然的免疫原性细胞死亡诱导剂，并阐明其提升免疫检查点疗法疗效
摘要
背景
尽管免疫检查点疗法为癌症治疗带来了革命性变革，但其疗效仍有限，主要原因在于存在非免疫原性和免疫抑制性的微环境。寻找天然来源的、能够诱导免疫原性细胞死亡的小分子物质，是克服这一治疗障碍的有效策略。
目的
本研究旨在发现天然的免疫原性细胞死亡诱导剂，并阐明其提升免疫检查点疗法疗效的机制。
方法
通过高通量筛选天然产物库来寻找潜在的免疫原性细胞死亡诱导剂。从韩国延龄草中分离出的三萜皂苷D被选为研究对象，对其机制和治疗效果进行了全面评估。通过检测损伤相关分子模式的释放情况来评估免疫原性细胞死亡的诱导效果。利用限制性蛋白酶解-质谱技术确定了PSD的直接细胞内靶标。同时还对线粒体功能、线粒体活性氧的产生以及铁死亡特征等下游机制变化进行了全面分析。
结果
PSD能显著促进损伤相关分子模式的释放，从而增强免疫原性应激反应。在体外和体内模型中，PSD处理均可通过促进树突状细胞的成熟并提升抗原呈递能力，进而激活CD8? T细胞反应，有效抑制肿瘤进展。从机制上看，PSD会直接与SHP2结合，干扰DRP1的聚合，导致线粒体功能紊乱，进而引发活性氧积累和脂质过氧化，最终导致细胞发生铁死亡。值得注意的是，PSD与抗PD-1疗法联合使用时具有显著的协同抗肿瘤作用，表现为cDC1和细胞毒性T细胞的浸润增加，同时免疫抑制细胞数量减少。
结论
我们的研究表明，SHP2介导的铁死亡可能是癌症免疫疗法的潜在靶点，同时PSD作为一种概念验证的先导化合物及临床前药物研究工具，有助于探索与免疫检查点疗法联用的新策略。
引言
免疫检查点疗法，尤其是针对程序性死亡1/程序性死亡配体1轴的疗法，通过恢复T细胞功能并维持对肿瘤生长的免疫控制，在多种癌症的治疗中展现了显著的临床效果（Sharma等人，2023；Wei等人，2018）。然而，仅有少数患者对这类疗法有响应，整体缓解率仍然不理想（Sharma等人，2021）。提升免疫检查点疗法疗效的一种有效方法是诱导免疫原性细胞死亡（ICD）（Zappasodi等人，2018）。ICD是一种特殊的细胞死亡类型，其特征是会释放诸如三磷酸腺苷、钙网蛋白和高移动性组盒1等损伤相关分子模式（Krysko等人，2012；Li等人，2022；Kroemer等人，2013）。这些分子模式能够促进树突状细胞的招募和活化，进而帮助呈现肿瘤抗原并激活依赖T细胞的免疫反应，同时也有助于形成长期免疫记忆（Garg等人，2016）。因此，ICD诱导剂为癌症免疫疗法提供了新的研究方向（Galluzzi等人，2024）。现有的ICD诱导剂，如某些化疗药物、放疗和光动力疗法，往往存在疗效不足、毒性高或易产生耐药性等问题（Xu等人，2024）。
近年来，铁死亡被认为是一种能够引发ICD的机制（Stockwell等人，2017）。铁死亡最初被定义为一种由脂质过氧化驱动的、需要铁元素参与的调控性细胞死亡方式，但最新研究表明，脂质过氧化产物可在肿瘤微环境中充当免疫原性信号（Ru等人，2024；Stockwell，2022）。这些信号能够提升常规树突状细胞的抗原呈递能力，进而增强对免疫检查点疗法的反应（Tang等人，2021；Wu等人，2026；Bell等人，2024；Ping等人，2024）。例如，脂质过氧化可作为一种“信号”，帮助呈现抗原，提升肿瘤免疫疗法的疗效（Song等人，2021；Xiao等人，2021）。此外，铁死亡过程中产生的脂质过氧化物和氧化应激还能促使损伤相关分子模式的释放，从而使肿瘤细胞更具免疫原性（Linkermann等人，2014；Riegman等人，2020）。不过，目前尚未完全明确将铁死亡与免疫原性联系起来的具体分子靶标，而且能够特异性诱导铁死亡并激发抗肿瘤免疫反应的小分子物质也极为有限。
受到生物活性天然产物在癌症治疗中应用价值的启发（Atanasov等人，2021），我们对天然产物库进行了筛选，寻找能够诱导ICD的物质。最终从韩国延龄草的根中提取出的皂苷D被认定为一种新的ICD诱导剂。我们证实，PSD能够提升肿瘤的免疫原性，促进树突状细胞成熟并改善抗原呈递能力，进而激活CD8? T细胞，从而抑制原发肿瘤的生长和肺转移。进一步的机制研究显示，PSD会直接与酪氨酸磷酸酶SHP2结合并稳定其结构，这种相互作用会干扰DRP1的聚合，导致线粒体功能紊乱，活性氧水平上升，最终引发铁死亡。此外，PSD与抗PD-1疗法联合使用时还具有显著的协同抗肿瘤作用。这项研究将PSD确定为一种新型的、依赖铁死亡的ICD诱导剂，不仅揭示了相关的机制，还为基于铁死亡的癌症免疫疗法策略的研究提供了有力的概念验证依据。
章节要点
细胞、化学试剂和抗体
MC38、ID8和OVCAR-8细胞来自中国医学科学院基础医学研究所（北京）。MC38-OVA细胞系是通过将MC38细胞稳定转染pCI-neo-mOVA载体（Addgene）而建立的（Yin等人，2023）。小鼠树突状细胞系DC2.4和B3Z杂交瘤由美国加利福尼亚大学伯克利分校的Nilabh Shastri博士提供。4T1-GFP-Luc细胞系则由Ke教授赠送。
确定PSD为强效的ICD诱导剂
为了寻找新的ICD诱导剂，我们利用HMGB1-GLuc荧光素酶试验（Yin等人，2023）以及ATP释放试验来检测这些典型损伤相关分子模式的释放情况（图1A）。通过对筛选结果的散点图分析，可以发现不同化合物对荧光素酶信号和ATP信号的影响存在差异，其中PSD在促进HMGB1-Gluc和ATP释放方面表现最为突出（图1B）。随后，我们在多种实验中进一步验证了PSD的ICD诱导能力。
讨论与结论
免疫抑制性的肿瘤微环境是一个动态且复杂的系统，会在癌症进展过程中不断发生变化，它在肿瘤的发生和发展以及治疗抵抗过程中起着重要作用（Bejarano等人，2021）。由于能够有效对抗肿瘤微环境中的免疫抑制状态，ICD已成为癌症免疫疗法的核心组成部分（Galluzzi等人，2024）。因此，能够诱导ICD的药物为突破传统治疗方法的局限性提供了新的思路。
作者贡献
孙翠翠和李丽对本研究做出了同等贡献。邓辉、肖丹、冯勇和刘晓负责研究的构思与设计；孙翠翠完成了大部分实验及后续的数据分析工作；李丽、董静文、王玉婷、龙宇、李睿和杨静参与了部分小鼠实验；刘勇和张娜负责合成PSD-炔烃和PSD-生物素；冯勇、刘晓和张娜则进行了分子对接研究，并协助构建过表达质粒。邓洪斌负责文章的审阅与编辑工作。
数据可用性
如有需要，通讯作者可以提供支持这些研究结果的相关数据。
CRediT作者贡献说明
孙翠翠：撰写——初稿，软件应用，方法学研究，实验实施。李丽：软件应用，资源获取。董静文：验证实验，软件应用。王玉婷：验证实验，软件应用。龙宇：验证实验，软件应用。李睿：验证实验，软件应用。杨静森：验证实验，软件应用。刘一辰：验证实验，软件应用。张娜：验证实验，软件应用。刘晓佳：验证实验，软件应用。冯彦春：验证实验，软件应用。肖典：验证实验，资源获取。邓洪斌：撰写——审稿与编辑。
利益冲突声明
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82473956、82273960、82402133、82304512）以及中国医学科学院医学创新基金（项目编号：2021-I2M-1-070）的资助。这些资助方并未对本研究的设计、数据收集、分析过程或论文投稿产生任何影响。
致谢
本研究同样得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82473956、82273960、82402133、82304512）以及中国医学科学院医学创新基金（项目编号：2021-I2M-1-070）的资助。这些资助方并未对本研究的设计、数据收集、分析过程或论文投稿产生任何影响。
孙翠翠|李丽|董静文|王玉婷|龙宇|李睿|杨静森|刘一辰|张娜|刘晓佳|冯彦春|肖典|邓洪斌
