《Phytomedicine》：Chelerythrine and Chelidonine Synergistically Target the Adenosine Pathway to Improve Anti-PD-L1 Immunotherapy Efficacy in Lung Cancer
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摘要背景尽管免疫检查点阻断疗法在晚期癌症治疗中取得了显著成效，但肿瘤微环境中的多种免疫抑制机制仍限制了其在许多患者中的疗效。细胞外腺苷信号通路是导致免疫抑制的重要因素，因此，抑制细胞外腺苷生成或信号传导的化合物已被用于单药治疗或与抗PD-L1疗法联合使用，并进入临床试验。目的本研
摘要
背景
尽管免疫检查点阻断疗法在晚期癌症治疗中取得了显著成效，但肿瘤微环境中的多种免疫抑制机制仍限制了其在许多患者中的疗效。细胞外腺苷信号通路是导致免疫抑制的重要因素，因此，抑制细胞外腺苷生成或信号传导的化合物已被用于单药治疗或与抗PD-L1疗法联合使用，并进入临床试验。
目的
本研究旨在从大黄属植物中筛选出能够靶向细胞外腺苷生成或信号通路的有效化合物，从而提升抗PD-L1免疫疗法在肺癌治疗中的效果。
方法
我们利用系统药理学平台筛选大黄属植物中的化合物，评估其潜在的抗肿瘤活性。通过Chou-Talalay方法分析这些候选化合物之间的协同作用。在同种异体Lewis肺癌小鼠模型中，检测了红景天素和大黄素增强抗PD-L1疗效的能力。随后，通过ELISA、定量实时PCR和Western blotting技术验证了在CC诱导的肿瘤微环境中细胞外腺苷的生成以及CD39/CD73信号通路的激活情况。此外，还通过流式细胞术、Transwell共培养实验和ELISA检测了CC对CD8+ T细胞的免疫调节作用。
结果
我们研究了来自大黄属植物的两种生物碱——红景天素和大黄素以1:1比例混合使用时，是否能通过抑制CD39/CD73轴上的细胞外腺苷生成及信号传导，进而增强携带LLC小鼠的CD8+ T细胞反应。计算模拟显示CC具有良好的抗肿瘤潜力，这一结果在体外和体内实验中都得到了验证。从机制上看，CC显著降低了CD39和CD73的表达，减轻了肿瘤微环境中的免疫抑制效应。同时，CC还能增加肿瘤内的CD8+ T细胞浸润并提升其细胞毒性功能，从而增强抗肿瘤免疫效应。此外，CC还能提高已形成的肿瘤中抗PD-L1疗法的疗效。
结论
本研究表明，CC可通过靶向细胞外腺苷通路以及CD39/CD73/A2AR轴，在肺癌模型中提升抗PD-L1免疫疗法的疗效。这些发现为将针对腺苷的疗法与免疫检查点阻断疗法结合使用提供了科学依据。
引言
针对程序性死亡蛋白1（PD-1）或程序性死亡配体1（PD-L1）的免疫检查点阻断疗法，因能在多种癌症类型中产生持久疗效，彻底改变了癌症治疗方法。然而，约有60%至80%的癌症患者无法从这类疗法中获益（Doroshow等人，2021年），且大约三分之一的患者在初始缓解后会复发（Allard等人，2020年；Takahara等人，2023年；Vijayan等人，2017年），这说明复杂的肿瘤微环境中存在其他免疫抑制机制。癌症中免疫逃逸的一个重要机制就是缺氧肿瘤中免疫抑制性腺苷水平升高。较高的细胞外腺苷浓度会削弱肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫功能，尤其是限制CD8+ T细胞的增殖和细胞毒性作用（Edgerton等人，2026年；Katsuta等人，2025年；Mastelic-Gavillet等人，2019年；Young等人，2014年）。因此，降低细胞外腺苷水平有望有效抑制肿瘤生长并增强肿瘤微环境中的免疫反应。细胞外腺苷是由细胞外ATP经外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1（CD39）和外5′-核苷酸酶（CD73）的依次作用水解产生的（Jeffrey等人，2020年）。一旦生成，细胞外腺苷就会与腺苷受体结合，尤其是高亲和力的腺苷受体A2a（A2AR），在肿瘤微环境中发挥免疫调节作用。已有研究表明，通过阻断CD39、CD73和/或A2AR来减少肿瘤产生的细胞外腺苷，可增强CD8+ T细胞的效应功能，进而提升多种肿瘤模型中的抗肿瘤免疫能力（Kurago等人，2023年；Liu等人，2022年；Liu等人，2025c年；Vignali等人，2023年）。此外，抗CD73药物（Furriel等人，2025年；Kaistha等人，2024年；Piovesan等人，2022年）、抗CD39药物（Jiang等人，2025年）以及A2AR抑制剂（Voronova等人，2021年；Willingham等人，2018年）也能显著提升小鼠体内抗PD-1/PD-L1疗法的疗效。不过，这类抑制剂的半衰期较短，针对具有特定构象的A2AR或CD73的抑制剂制备难度较大（Vijayan等人，2017年），且可能存在难以预测的副作用，这些都是限制其临床应用效果的主要因素。因此，亟需寻找高效且易获取、具有良好药理活性的替代药物，以便开发基于腺苷的癌症治疗策略。
大黄属植物是罂粟科的一种传统药用植物，自中世纪起就在欧洲和西亚地区被用于治疗多种疾病（Colombo和Bosisio，1996年）。近期研究发现了大黄属植物提取物多种生物活性，包括抗肿瘤作用（Hesami等人，2022年；Och等人，2019年；Popovic等人，2022年；Tuzimski等人，2023年）。该植物中分离出的多种生物碱的抗肿瘤作用也在体外和体内实验中得到了研究，其中包括大黄素（CD），相关研究由Jang等人（2021年）以及Liu等人（2025b年；Xie等人，2020年）开展；还有红景天素（CR），相关研究由Chen等人（2022年；Duda-Madej等人，2024年；Liu等人，2025a年）完成。然而，由于这种草药中含有多种成分，且肿瘤微环境的免疫抑制机制十分复杂，目前尚不清楚大黄属植物是否是通过调控细胞外腺苷来发挥抗肿瘤作用的。
为了解答这一问题，我们首先运用系统药理学方法，从大黄属植物中筛选出具有优异特性的生物活性化合物，并预测与癌症相关的分子靶点。随后我们发现，红景天素与大黄素联合使用可在LLC小鼠模型中减轻肿瘤负荷。在LLC肿瘤微环境中，这种组合通过抑制CD39/CD73介导的细胞外ATP水解为细胞外腺苷的过程，从而促进抗肿瘤反应。细胞外腺苷水平的下降通过A2AR依赖性机制提升了CD8+ T细胞的增殖、活化及细胞毒性功能。最后，这种组合还能提升PD-L1阻断疗法的抗肿瘤效果。这些发现为开发单独使用或与现有癌症免疫疗法联用的腺苷通路抑制策略提供了理论支持。
章节摘录
人类组织采集
在上海外度生物科技有限公司伦理委员会批准后（批准号YBM-05-02），我们纳入了15名未经治疗、病理学确诊的原发性非转移性肺腺癌或肺鳞癌患者。这些患者的肿瘤部位及其周围的正常组织是通过手术活检获取的。获取样本后，我们会立即将其置于液氮中用于RNA或蛋白质分析，之后再将样本存放在-80°C的冰箱中。整个实验过程均遵循相关伦理规范进行。
CC在体外和体内具有抗增殖和抗肿瘤活性
首先，我们运用系统药理学方法研究大黄属植物是否具有抗肿瘤活性。ADME筛选出了22种符合筛选标准的化合物（见表S1）：氧化稳定性OB值≥30%，氢键供体数量HL值≥4（较高），LogP值DL值≥0.18。在大黄属植物提取物中含量最高的生物碱是大黄素（分子式15，见图S1），它具有较好的预测性能（OB值为48.32%，HL值为7.61，LogP值为0.86），且有研究显示它能抑制四种癌细胞的增殖（Huang等人，2020年）。此外，红景天素也
讨论
肿瘤微环境中的各种免疫抑制机制，包括细胞外腺苷信号通路，都会促进免疫逃逸，增加患者对免疫检查点疗法的耐药性（Allard等人，2020年；Darvin等人，2018年）。在缺氧肿瘤中，细胞外腺苷的浓度会显著升高（Blay等人，1997年；Busse和Vaupel，1996年），并通过A2AR依赖性信号通路引发局部免疫抑制作用（de Lera Ruiz等人，2014年；Hatfield等人，2015年；Ohta等人，2006年）。在本研究中，我们发现CC在肺癌治疗中具有抗肿瘤作用。
CRediT作者贡献说明
朱静林：负责初稿撰写、论文审阅与编辑、研究工作以及资金申请。黄瑞菲：负责初稿撰写及论文审阅与编辑工作。黄超：负责研究构思、方法设计、实验监督、资金申请以及论文审阅与编辑。严江娜：负责方法设计、研究实施以及数据分析工作。张玉茹：负责方法设计、实验监督以及软件和数据管理。肖月：负责实验监督和研究工作。杨瑞杰：负责软件使用和数据管理。刘振妮：
CRediT作者贡献说明
朱静林：负责初稿撰写、资金申请以及数据管理。黄瑞菲：负责初稿撰写、数据管理、研究构思工作。黄超：负责实验监督、资金申请、数据管理以及研究构思。严江娜：负责初稿撰写、研究实施、数据分析以及研究构思。张玉茹：负责软件使用和方法设计工作。肖月：负责数据可视化、软件使用以及数据管理。杨瑞杰：负责方法设计以及数据管理。刘振妮：负责论文审阅与编辑、方法设计工作，
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号为32360156、32200522和32460186）、中国博士后科学基金会（项目编号2023M732809，资助对象为C.H.）、陕西省博士后支持计划（项目编号2023BSHEDZZ68，资助对象为C.H.）以及延安大学博士科研启动项目的支持（项目编号为YDBK-2022-73和YDBK-2022-77）。此外，我们还要衷心感谢江苏凯尼恩制药有限公司为本研究提供了大部分实验平台支持。
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