空间转录组学揭示的人类心脏同种异体移植排斥反应的动态细胞程序

《Nature Cardiovascular Research》：Dynamic cellular programs of human cardiac allograft rejection revealed by spatial transcriptomics

　　

实体器官移植后的同种异体移植排斥反应是移植物功能障碍和死亡的主要原因。当前的诊断方法依赖于组织学，其表现出广泛的诊断变异性，并且缺乏临床相关的分子分型。在此，研究人员利用亚细胞分辨率的基于图像的空间转录组学（spatial transcriptomics）对纵向人类心脏活检样本进行分析，以表征62名成人和儿童心脏移植受者在组织学诊断的排斥反应期间和之后的转录异质性。在28种细胞类型中，研究人员识别出不同排斥反应类型中免疫细胞和实质细胞丰度的显著差异。研究人员观察到排斥反应严重程度之间的转录状态存在广泛重叠，以及排斥反应分级内的显著异质性。对强化治疗有反应者和无反应者具有不同的转录组学图谱，无反应者表现出基线T细胞过度激活和组织重塑基因。研究人员还识别出与心脏移植后长期结局相关的细胞特异性基因。这些结果强调了在排斥反应期间对细胞状态进行亚型分型以分层与短期和长期结局相关的免疫-心脏相互作用的重要性。

**研究背景**
实体器官移植是终末期器官衰竭的最终治疗手段，但同种异体移植排斥反应在移植后早期常见（约40%的受者术后1年内经历排斥），导致长期移植物衰竭和死亡。当前诊断急性排斥反应及其治疗反应依赖组织学，但存在观察者间变异，影响免疫调节治疗的精准性，并可能导致过度或免疫抑制不足的临床后果。心脏移植（HT）是这一过程的典型场景：急性排斥影响约20%的受者，并使其面临慢性排斥表型（心脏同种异体移植血管病变，CAV）的风险，从而限制长期生存。排斥严重程度通过侵入性心内膜心肌活检（EMB）分级，但组织学单独无法精确表型排斥：（1）同一组织学排斥分级内临床表现差异巨大；（2）抗排斥治疗反应异质性，包括部分患者无反应。此外，急性排斥及其消退与长期结局（如CAV）之间仍存在显著差距。鉴于EMB在HT后常规用于组织学排斥监测，HT为研究更深层次空间分辨的分子图谱提供了独特环境，可能指导精准方法。

**研究内容与结论**
研究人员对62名成人和儿童心脏移植受者的纵向EMB进行亚细胞分辨率的空间转录组学，表征排斥期间及治疗后的转录图谱。研究涵盖28种细胞类型，发现不同排斥类型和分级内的显著分子异质性，识别出治疗反应者与无反应者的基线差异，并将细胞特异性基因表达与CAV发展相关联。研究揭示了组织学掩盖的分子异质性，为急性排斥诊断、治疗反应预测和CAV风险分层提供了宝贵资源。该论文发表在《Nature Cardiovascular Research》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用Xenium平台进行空间转录组学，采用靶向基因面板（477个基因，包括预设计的人类多组织和癌症面板及100个自定义基因）。样本来自范德堡大学医学中心（Vanderbilt University Medical Center）2017年至2023年间的成人和儿童HT受者，共62名。从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）EMB构建组织微阵列（TMA），每个样本两个0.6mm核心。利用亚细胞分辨率解码mRNA定位，并通过H&E染色整合组织学图像。细胞分割、聚类和注释使用Seurat和RAPIDS，差异表达采用线性模型，CAV关联使用广义线性混合模型（GLMM）。验证使用外部EMB微阵列数据集（GSE150059）和单核RNA-seq数据。

**研究结果**

**研究参与者**
研究人员获取了49名成人和13名儿童HT受者的纵向EMB，中位年龄分别为52岁和6岁。活检在排斥诊断时及免疫调节治疗后采集，涵盖急性细胞排斥（ACR）、抗体介导排斥（AMR）和混合排斥。通过临床试验标准分级，并选用经验丰富的病理学家（R.D.H.）复核。

**急性排斥的组成和空间景观揭示HT后功能性相关细胞类型**
通过测量162,638个细胞中的10,343,560个高质量转录本，识别出28种细胞类型，包括POSTN⁺活化成纤维细胞、BMX⁺活化内皮细胞、SPP1⁺巨噬细胞等。在ACR中，CD8⁺T细胞、增殖T细胞、B细胞、cDC1、成纤维细胞和SPP1⁺巨噬细胞比例最高；在AMR中，内皮细胞、浆细胞、心肌细胞、巨噬细胞和增殖周细胞比例最高。空间邻近分析显示，ACR中T细胞亚群与pDC、mDC共定位，NK细胞与内皮细胞、周细胞邻近；AMR中巨噬细胞与成纤维细胞亚型共定位，成纤维细胞与BMX⁺活化内皮细胞和增殖周细胞邻近。

**组织学排斥分级内和跨分级存在显著转录异质性**
通过TMA级组织学分级，发现ACR ≤2R分级活检的细胞转录相似性较高，而3R分级具有独特分子图谱。主成分分析（PCA）和层次聚类显示，组织学分级不能清晰分离排斥类型或严重程度，表明组织学掩盖的分子异质性可能解释临床变异性。

**空间转录组学解析ACR与AMR之间的功能相关基因表达模式**
比较ACR和AMR，识别出78个显著基因-细胞类型对（FDR <0.05），涉及70个基因和11种细胞类型。ACR中增殖T细胞、cDC1和肥大细胞差异表达基因最多。ACR与T细胞激活、干扰素诱导基因上调相关，包括淋巴归巢基因（CCR7、SELL、CXCR3）和共刺激通路（CD27、CD40-CD40L、SLAMF1）。AMR中肥大细胞表达IgE轴和前列腺素D2合成基因。基因集富集分析（GSEA）显示ACR中CD8⁺T细胞和巨噬细胞富集IFNγ信号，B细胞和活化内皮细胞富集补体通路。

**ACR与AMR之间的差异表达基因在bulk研究中未完全重现**
与外部EMB微阵列数据集（GSE150059，76名ACR vs 179名AMR）比较，65个基因中53个方向一致，但12个不一致，表明空间转录组学比bulk方法更精确地捕获细胞特异性信号。

**空间转录组学揭示急性细胞排斥消退与持续之间的转录状态差异**
比较治疗反应者（ACR消退）与无反应者（持续排斥），发现无反应者基线时CD8⁺T细胞中T细胞受体信号和活化标记（CD3E、CD247、CD28、CD69）及记忆T细胞相关基因（IL7R、GATA3）高表达，巨噬细胞中MRC1高表达，周细胞中ASPN、心肌细胞和内皮细胞中DCN上调。反应者则富集炎症、TNF信号和IL6-JAK-STAT3通路。

**与CAV相关的细胞特异性基因图谱**
所有活检中，识别出323个显著基因-细胞类型对（198个基因，26种细胞类型），与CAV相关。ACR中包括血管生成（ADGRL4）、血管炎症（CX3CL1、BET基因、VCAM1）和增殖（FAS）通路基因。治疗后，仍有45个基因与CAV相关，集中于微血管和支持细胞，如COL1A2在增殖内皮细胞中，MTOR、FLOT1在肌成纤维细胞中。GSEA显示血管内皮-间充质转化通路富集。

**空间转录组学识别急性排斥期间和之后改变的细胞特异性基因，这些基因在严重CAV中失调**
与终末期CAV患者心肌的单核RNA-seq数据比较，发现CAV相关基因（如PECAM1、VCAM1、ICAM1、POSTN）在相同细胞类型中高表达，验证了早期免疫现象与长期CAV的转录关联。

**总结讨论**
研究结论：总之，研究人员的研究在成人和儿童心脏移植中建立了跨排斥类型和同一排斥分级内的显著分子异质性，而仅靠组织学无法发现这些异质性。此外，研究人员利用纵向心脏活检识别出不同的细胞特异性基因表达模式，这些模式在bulk研究中仅部分重现，并涉及治疗响应的动态变化。最后，研究人员将细胞特异性基因表达与高度相关的临床结局（即慢性排斥（CAV））联系起来，并显示在终末期CAV中存在相似的细胞特异性基因表达。总体而言，研究结果阐明了心脏同种异体移植排斥反应中的细胞动力学，并为更大的移植科学界提供了宝贵资源。研究人员期待这项工作成为实体器官移植精准医学方向的一步。