靶向RANKL预防早衰小鼠的骨丢失、改善肌肉功能并延长寿命

《Aging Cell》：Targeting RANKL Prevents Bone Loss, Improves Muscle Function and Extends Lifespan in Progeroid Mice

　　

Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）是一种罕见的遗传性疾病，其特征是早期出现与衰老相关的病理特征，最终导致过早死亡。HGPS主要影响间充质来源的组织，这从该早衰性疾病的临床表现中得以证实，包括但不限于骨质疏松、肌肉萎缩、脂肪营养不良和心血管疾病。在本研究中，研究人员使用临床前小鼠模型以及遗传和转化方法，探究基于RANKL靶向的抗骨吸收策略是否能够改善早衰小鼠的骨丢失表型。研究人员在此表明，在HGPS的Zmpste24^-/-小鼠模型中，骨细胞来源的RANKL缺失逆转了长骨和椎骨的骨丢失。这些小鼠还表现出握力增强和耐力改善。此外，骨细胞特异性RANKL缺失后，Zmpste24^-/-小鼠的存活率增加。值得注意的是，使用基于抗RANKL中和抗体的转化方法也恢复了骨量、减少了肌肉纤维化并延长了Zmpste24^-/-小鼠的寿命。总之，这些发现支持靶向RANKL对HGPS的骨性和骨外表型均产生有益作用，提示该治疗方法在探索治疗此疾病方面具有潜力。

**论文解读：靶向RANKL改善早衰小鼠骨丢失、肌肉功能并延长寿命**

**研究背景**

Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）是一种罕见的、由LMNA基因点突变（c.1824C>T, p.G608G）引起的遗传性疾病，导致异常剪接产生的法尼基化突变蛋白——早衰蛋白（progerin）积累。早衰蛋白破坏核膜结构，引发一系列早衰表型，包括骨质疏松、肌肉萎缩、脂肪代谢障碍和心血管疾病，患者平均寿命仅14.6年。其他早衰性核纤层蛋白病，如Mandibuloacral dysplasia type B（MADB）和Restrictive dermopathy（RD），则由ZMPSTE24基因突变引起，导致法尼基化prelamin A积累，同样表现出严重的骨骼异常（如骨质疏松、远端指骨和锁骨溶骨）。尽管存在异质性，这些疾病共享严重的骨骼表型，为研究骨代谢机制及开发治疗策略提供了模型。

目前，抗骨吸收疗法（如双膦酸盐）在HGPS模型中显示了改善骨表型的潜力，但常与普仑奈抑制剂联合使用，其单独效果未明确。RANKL（receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand）是破骨细胞分化和骨吸收的关键细胞因子，其抑制剂地舒单抗（denosumab）已用于年龄相关性骨质疏松治疗。近年研究还发现，RANKL在骨骼肌中表达，且靶向RANKL可改善肌营养不良或肌肉减少症模型中的肌肉功能。因此，研究人员提出假设：靶向RANKL能否同时改善早衰模型（Zmpste24^-/-小鼠）中的骨丢失、肌肉功能障碍，并延长寿命？

**主要技术方法**

研究人员采用遗传学方法（将RANKL^fl/fl小鼠与Dmp1-Cre转基因小鼠杂交，获得骨细胞特异性RANKL缺失的Zmpste24^-/-小鼠，即Zmpste24^-/-/RANKL^fl/fl/Dmp1-Cre小鼠）和药理学方法（从8周龄开始，每周两次皮下注射抗小鼠RANKL单克隆抗体或同型对照IgG2a，剂量5 mg/kg）。通过微型计算机断层扫描（μCT）分析胫骨和椎骨小梁及皮质骨参数；疲劳转棒实验和握力测试评估肌肉功能；组织学染色（Gomori三色、地衣红、HE）和免疫组化评估肌肉纤维化、血管形态及弹性纤维；羟脯氨酸含量测定量化胶原沉积；ELISA检测血清骨转换标志物（CTX-I、TRAcP 5b）、生长因子（BMP-2、TGF-β1）及钙磷代谢指标；实时定量PCR检测骨、肌肉和主动脉中相关基因表达；主动脉钙含量定量使用比色法；Kaplan-Meier生存曲线分析寿命。样本来源于实验室培育的Zmpste24^-/-小鼠（C57BL/6背景）及RANKL^fl/fl和Dmp1-Cre品系（Jackson实验室）。

**研究结果**

**2.1 骨细胞RANKL缺失预防Zmpste24^-/-小鼠的骨质疏松表型**

通过μCT分析约6.5月龄小鼠胫骨，发现Zmpste24^-/-/RANKL^fl/fl小鼠相比野生型同窝鼠（Zmpste24^+/+/RANKL^fl/fl）表现出显著骨丢失，表现为骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）降低，骨小梁分离度（Tb.Sp）增加。而骨细胞特异性RANKL缺失（Zmpste24^-/-/RANKL^fl/fl/Dmp1-Cre小鼠）显著逆转了这些参数，使皮质骨面积（Ct.Ar）和皮质厚度（Ct.Th）也恢复至接近野生型水平。椎骨小梁骨分析同样显示RANKL缺失改善了脊柱骨结构。血清骨吸收标志物TRAcP 5b在两种早衰小鼠中均降低，但RANKL缺失组胫骨中Rankl/Opg比值降低，提示局部骨吸收减少。此外，Zmpste24^-/-/RANKL^fl/fl小鼠血清中BMP-2和TGF-β1水平升高，而RANKL缺失后部分减弱（未达统计学意义）。

**2.2 靶向骨细胞RANKL改善Zmpste24^-/-小鼠的肌肉功能**

疲劳转棒实验显示，Zmpste24^-/-/RANKL^fl/fl小鼠的总跑动距离显著低于野生型，而RANKL缺失后显著改善。握力测试同样显示，早衰小鼠握力降低，但RANKL缺失后恢复。基因表达分析显示，早衰小鼠中肌源性分化因子Myod1 mRNA表达降低，RANKL缺失后部分恢复；肌球蛋白重链基因Myh2表达降低但未受RANKL缺失影响。组织学分析发现，早衰小鼠股四头肌纤维化增加（Gomori三色染色和羟脯氨酸含量升高），而RANKL缺失后显著减轻。

**2.3 骨细胞RANKL缺失对Zmpste24^-/-小鼠血管表型和钙沉积的影响**

主动脉组织学分析显示，各组间血管平滑肌细胞（VSMC）数量、中膜和内膜厚度无显著差异，弹性纤维结构和α-SMA表达也正常，表明Zmpste24^-/-小鼠未重现典型的HGPS血管平滑肌丢失。但基因表达分析发现，早衰小鼠主动脉中Enpp1和Entpd1 mRNA水平显著降低（参与磷酸盐代谢），且RANKL缺失未恢复。主动脉钙含量定量显示，早衰小鼠钙含量升高，而RANKL缺失后降低（未达统计学意义）。

**2.4 骨细胞特异性RANKL缺失增加Zmpste24^-/-小鼠的存活率**

生存曲线分析显示，相比Zmpste24^-/-/RANKL^fl/fl小鼠（中位寿命230天），Zmpste24^-/-/RANKL^fl/fl/Dmp1-Cre小鼠中位寿命延长至276天（增加20%，p=0.0096，Gehan-Breslow-Wilcoxon检验）。性别分层分析显示，雄性小鼠主要受益于早期死亡减少，而雌性小鼠最大寿命显著延长，并伴有体重改善。

**2.5 抗RANKL治疗改善Zmpste24^-/-小鼠表型并延长寿命**

使用抗RANKL抗体治疗后，μCT分析显示胫骨小梁骨参数（BMD、BV/TV、Tb.Th）显著升高，Tb.Sp降低，皮质骨也得到保护。肌肉羟脯氨酸含量显著降低，表明纤维化减轻。此外，早衰小鼠的特征性低血糖（低血糖症）在治疗后得到改善。生存分析显示，抗RANKL治疗组的中位生存期显著延长（p=0.0328，Log-rank检验），其中雌性效应更明显，但分组后未达统计学意义。体重方面，治疗组雌性小鼠体重略有改善。

**讨论与结论**

讨论部分指出，该研究首次证明单用靶向RANKL（而非联合其他药物）即可有效改善早衰小鼠的骨丢失，且对肌肉功能（减少纤维化、改善握力和耐力）和血管钙化（趋势性降低）产生额外益处，最终延长寿命。这些效应可能源于骨-肌肉串扰的改善（如骨细胞RANKL缺失后局部骨重塑减少，影响肌肉微环境），或RANKL信号直接作用于肌肉和血管。此外，血液循环中BMP-2和TGF-β1水平的改变提示骨内分泌环境可能参与系统性表型改善。尽管血管钙化未完全逆转，但钙含量降低趋势可能部分贡献于生存获益。然而，由于疾病的复杂性，单一靶向通路可能无法完全纠正病理表型，进一步研究需明确RANKL在早衰肌肉功能障碍中的具体作用。

**结论**：研究人员证明，靶向RANKL是挽救早衰性Zmpste24^-/-小鼠骨质疏松表型的有效策略，同时在骨外组织（肌肉、血管）提供额外益处，最终改善生存率。需要进一步深入研究评估RANKL抑制作为HGPS治疗方法的全部潜力。