《Plant Science》：Multiplexed CRISPR/Cas9 mediated knockdown of BCH gene in potato enhances beta-carotene to combat Vitamin A Deficiency
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摘要农作物中前维生素A类胡萝卜素含量不足是导致维生素A缺乏症普遍存在的问题，进而引发人类营养不良和失明。抑制β-胡萝卜素羟化酶（BCH）可提高β-胡萝卜素水平。在本研究中，我们采用多重CRISPR/Cas9技术，针对本地马铃薯品种中的BCH基因设计了三个靶点。转化效率为15%，通
摘要
农作物中前维生素A类胡萝卜素含量不足是导致维生素A缺乏症普遍存在的问题，进而引发人类营养不良和失明。抑制β-胡萝卜素羟化酶（BCH）可提高β-胡萝卜素水平。在本研究中，我们采用多重CRISPR/Cas9技术，针对本地马铃薯品种中的BCH基因设计了三个靶点。转化效率为15%，通过PCR确认CRISPR/Cas9-BCH多重构建体已成功整合到马铃薯中。使用TIDE软件分析后，Sanger测序显示第7株植物的插入缺失效应最高，为92.1%，而第1株为26.6%。qRT-PCR分析表明，与对照组相比，基因编辑后的马铃薯植株中BCH转录本水平下降了89倍。分光光度法检测显示，基因编辑后的马铃薯植株中β-胡萝卜素含量显著上升，范围从0.831μg/mLFW到4.236μg/mLFW，而对照组的最低β-胡萝卜素浓度为0.344μg/mLFW。HPLC分析进一步证实，基因编辑后的马铃薯植株中β-胡萝卜素含量在0.11mg/mLFW到0.36mg/mLFW之间，而未经过改造的对照组的最低值为0.09mg/mL。我们的研究结果表明，针对BCH基因的多重CRISPR-Cas9技术能够提升马铃薯块茎中的β-胡萝卜素含量。
引言
马铃薯（Solanum tuberosum L.）是一种具有很高营养价值的主食作物，主要通过复杂碳水化合物为人体提供能量。它天然脂肪含量低，所含蛋白质质量高，生物价在90到100之间，这一数值对于植物性食物来说已经非常高了（Camire等人，2009；Zaheer和Akhtar，2016）。此外，马铃薯还富含多种必需的微量营养素，包括钾、维生素C以及多种B族维生素，其表皮则是膳食纤维的优质来源（Burgos等人，2020）。近年来，由于色素型马铃薯品种含有更多的抗氧化物质，因此越来越受到关注，这些抗氧化物质有助于提升其营养价值和健康益处（Andre等人，2007；Lachman等人，2012）。
为了满足人类的营养需求，马铃薯、大米和小麦等重要粮食作物不可或缺。然而，和其他主要主食作物一样，马铃薯中也含有较低水平的前维生素A类胡萝卜素，包括β-胡萝卜素（Chitchumroonchokchai等人，2017）。在那些以马铃薯为主食且缺乏适当补充或饮食多样性的地区，这种营养不足导致了维生素A缺乏症的普遍流行，而该疾病在许多发展中国家构成了严重的公共卫生问题（世界卫生组织，2009；Stevens等人，2015）。维生素A缺乏症是导致儿童失明的主要原因之一，通常表现为干眼病，同时还会削弱免疫功能，增加患麻疹和腹泻等疾病的风险，从而进一步提高发病率和死亡率（Sommer和Davidson，2002；Wiseman等人，2017）。因此，通过增强马铃薯块茎中β-胡萝卜素的积累来改善其营养价值的生物强化策略，是一种有望解决弱势群体维生素A缺乏问题的可持续方法。人们试图通过抑制阻止β-胡萝卜素形成的基因，提高马铃薯块茎中的前维生素A含量（Datir和Regan，2022）。
β-胡萝卜素是维生素A合成的主要膳食前体，它会在β-胡萝卜素15,15′-双加氧酶（BCO1）的作用下被分解，生成视黄醛，随后再转化为视黄醇（von Lintig，2010）。维生素A对视觉功能、免疫功能、基因调控以及上皮组织维护都至关重要（D’Ambrosio等人，2011；Wiseman等人，2017）。全球约有1.9亿儿童患有维生素A缺乏症，因此通过膳食补充β-胡萝卜素来强化其营养价值是一种极为重要的干预措施（Stevens等人，2015）。
在类胡萝卜素合成途径中，β-胡萝卜素会通过β-胡萝卜素羟化酶（BCH）的作用被羟基化成叶黄素，该酶会在β-胡萝卜素的每个β-离子酮环上添加一个羟基（Huang等人，2021）。因此，如果降低BCH的表达，就能阻止这一转化过程，从而增加β-胡萝卜素的积累。此前已有研究通过RNAi技术沉默马铃薯中的BCH基因，成功提升了块茎中的β-胡萝卜素含量（Van Eck等人，2007）。不过，目前还没有关于利用CRISPR/Cas9技术进行多重基因组编辑以降低马铃薯中BCH基因表达的研究报道，这也凸显了本研究的创新性。
章节节选
植物材料
对当地种植的AGB Purple马铃薯品种的块茎芽进行了表面消毒。如Bakhsh（2020）所提到的，这些块茎芽在MS培养基上培育出了体外芽苗。这些芽苗被放置在温度为（25±2）°C、光照周期为16/8小时、培养表面光照强度为47 μmol/(m-2·s)的培养室中，光照由58瓦的荧光灯提供。遗传转化实验则是通过茎部进行的
构建体制备
我们成功制备了针对BCH基因的CRISPR/Cas9多重gRNA构建体，该构建体包含三个sgRNAs，随后被导入大肠杆菌（DH5α）细胞中。图1a展示了pDe-Cas9/BCH多重构建体的结构图，其中U6-26启动子呈绿色，转运RNA呈浅蓝色，三个靶点呈紫色，嵌合RNA呈芥末黄色，终止序列则呈桃色。通过菌落PCR扩增出357bp的片段，验证了Gateway连接反应的有效性（图1b）。
讨论
马铃薯（Solanum tuberosum L.）是全球第三大重要粮食作物，仅次于水稻和小麦，在人类营养方面发挥着重要作用（Zhang等人，2017）。由于其高度的适应性以及均衡的碳水化合物、蛋白质、脂质和微量营养素含量，马铃薯在全球粮食安全和营养保障方面具有重要意义（Burgos等人，2020）。然而，传统马铃薯品种中的前维生素A类胡萝卜素，尤其是β-胡萝卜素含量相对较低
结论
本研究通过成功运用CRISPR Cas多重技术敲低BCH基因，实现了马铃薯中β-胡萝卜素含量的提升，而β-胡萝卜素正是维生素A的前体。此外，mRNA表达定量分析、Sanger测序结果解读以及HPLC分析都表明，敲低效率与β-胡萝卜素含量之间存在正相关关系。本研究所得到的材料在马铃薯育种工作中具有巨大应用潜力，有望培育出具有更高营养价值的马铃薯品种
作者贡献
AQR和AAS负责这项研究的构思与设计。所有实验工作均由UJ和AY完成，他们还撰写了文章的初稿。在遗传转化实验中，MA、AL和NS提供了协助并记录了相关数据。表型分析和突变筛选工作则由SA、AB和NA协助完成。整个研究由AQR和AAS负责监督，他们还对文章进行了细致修改，使其达到目前的呈现形式。
未引用参考文献
(Ahmed等人，2013；Andersson等人，2017；Andersson等人，2018；Butler等人，2015；Butler等人，2016；Gurusaravanan等人，2020；Helliwell和Waterhouse，2003；Hodge和Taylor，2022；Jalali-Jivan等人，2022；Khan等人，2017；Khromov等人，2018；Veillet等人，2020；Vishvakarma等人，2023；Yasmeen等人，2023)
CRediT作者贡献说明
Naila Shahid：写作——审阅与编辑、方法学、正式分析。Nadeem Ahmad：方法学、正式分析。Allah Bakhsh：写作——初稿撰写、正式分析、数据整理。Ayesha Latif：写作——审阅与编辑、验证、软件应用。Aneela Yasmeen：写作——初稿撰写、可视化、验证、项目管理、方法学、研究实施。Ujala Nasir：写作——初稿撰写、可视化、方法学、研究实施、正式分析。Ahmad Ali Shahid：写作——
致谢
无
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
Ujala Nasir|Aneela Yasmeen|Muhammad Awais|Ayesha Latif|Allah Bakhsh|Nadeem Ahmad|Naila Shahid|Saira Azam|Abdul Qayyum Rao|Ahmad Ali Shahid
巴基斯坦拉合尔53700，旁遮普大学分子生物学卓越中心（CEMB），87-West Canal Bank Road
