综述：CRISPR/Cas编辑用于小麦非生物胁迫抗性：靶标就绪度、剂量约束和田间转化

《Plant Stress》：CRISPR/Cas Editing for Abiotic Stress Resilience in Wheat: Target Readiness, Dosage Constraints, and Field Translation

　　

非生物胁迫（abiotic stress），特别是干旱（drought）、高温（heat）和盐碱（salinity），在气候变化背景下日益威胁小麦（wheat）的生产力和产量稳定性。CRISPR/Cas介导的基因组编辑（CRISPR/Cas-mediated genome editing）为修改与胁迫适应相关的基因提供了新机遇，但其对田间水平小麦抗性（field-level wheat resilience）的贡献仍然有限。在六倍体小麦（hexaploid wheat）中，转化成功不仅取决于编辑效率（editing efficiency），还取决于同源等位基因剂量（homoeolog dosage）、编辑方向（editing direction）、多效性风险（pleiotropic risk）、发育阶段（developmental stage）、环境间稳定性（stability across environments）和育种兼容性（breeding compatibility）。本综述通过结构化文献检索和证据分类，评估了CRISPR/Cas策略及代表性小麦胁迫相关靶标。比较分析表明，就绪度（readiness）因靶标-编辑配置（target-edit configurations）而异，而非整个胁迫类别。许多干旱和高温相关调节因子具有强大的机制支持，但剂量、生殖或田间验证有限，而一些盐碱相关配置显示出更清晰的生理关系，但仍需多环境测试。因此，研究人员基于因果证据（causal evidence）、编辑方向与同源等位基因分辨率（homoeolog resolution）、农艺可预测性（agronomic predictability）、验证深度（validation depth）和育种可部署性（breeding deployability），操作化了一个CRISPR翻译就绪度框架（CRISPR Translation Readiness Framework）。代表性配置被分类为探索性（exploratory）、发展性（developmental）或高级（advanced），并设有资格规则，以防止尽管有强功能证据但有害的编辑被优先考虑。未来进展需要调控与精准编辑（regulatory and precision editing）、现实的生殖与产量表型分析（reproductive and yield phenotyping）、同源等位基因配置的透明报告，以及在精英种质（elite germplasm）中的早期部署。这一面向翻译的框架为优先考虑具有更大潜力支持气候适应性小麦改良的CRISPR干预措施提供了基础。

**1. Introduction**
全球小麦生产日益受到气候变化相关非生物胁迫（abiotic stress）的威胁，特别是干旱（drought）、高温（heat）和盐碱（salinity）。这些胁迫降低产量潜力，破坏谷物生产稳定性，且常以组合形式出现。其影响尤其严重，因为小麦生产力不仅取决于胁迫生存，还取决于在多变环境中维持生长、生殖发育、籽粒灌浆和产量稳定。气候变异性已导致多个主要产区产量不稳定和增产停滞，引发对传统育种能否在日益不稳定的气候条件下提供足够遗传改良的担忧。因此，开发在胁迫易发环境下维持生产力的小麦品种成为作物改良的主要优先事项。CRISPR/Cas介导的基因组编辑（CRISPR/Cas-mediated genome editing）通过实现胁迫响应、发育、产量形成和籽粒质量相关基因的靶向修饰，为加速小麦改良创造了新机遇。在小麦中，基因组编辑已成功应用于多种性状，包括抗病性、籽粒大小、淀粉组成、面筋含量、株型和非生物胁迫耐受性。然而，分子水平上的基因组编辑成功并不保证田间条件下的农艺改良。这一区别对非生物胁迫抗性（abiotic stress resilience）尤为重要，因为编辑后的表型通常在简化的实验室或温室条件下评估，未能完全捕捉田间胁迫环境的时空和生物学复杂性。事实上，许多编辑小麦品系在受控条件下表现出改善的生理或形态性状，但只有少数在田间环境下表现出稳定的产量效益。挑战在面包小麦中尤为突出，因为它具有异源六倍体基因组结构（allohexaploid genome structure）。大多数基因在A、B和D亚基因组上有三个同源拷贝（homoeologous copies），造成功能冗余、剂量效应（dosage effects）和同源等位基因间的潜在补偿。因此，编辑单个拷贝可能产生弱或不可检测的表型效应，而编辑多个同源拷贝可产生更强响应，但也可能增加多效性惩罚（pleiotropic penalties）或改变发育平衡的风险。这种剂量敏感的遗传结构使靶标选择复杂化，并使编辑基因型与胁迫抗性表型之间的关系难以预测。问题还因基因型依赖的转化和再生而加剧，因为许多成功的编辑研究是在转化兼容的品种中进行的，而非精英或区域适应性育种材料。非生物胁迫性状本身也内在复杂。干旱耐受性涉及水分获取、根系构型、气孔调节、渗透调节、生殖稳定性和恢复能力。高温耐受性强烈依赖于发育阶段，尤其是生殖阶段敏感性和籽粒灌浆稳定性。盐碱耐受性需要离子排斥、区隔化、渗透平衡、组织耐受性和生长维持的协调控制。这些性状很少由具有直接稳定效应的单一基因控制，而是由受遗传背景、胁迫强度、发育时序和环境相互作用强烈影响的相互连接调控网络所支配。因此，广泛的调控靶标如转录因子和胁迫信号组分可能产生有希望的早期表型，但田间表现不确定。相比之下，一些生理上直接的靶标，如参与盐碱耐受性的离子转运蛋白，可能提供更清晰的转化潜力，但即便如此也需要剂量感知编辑和多环境验证。本综述强调，CRISPR/Cas应用于小麦胁迫抗性的一个主要限制不仅是产生编辑的能力，而是识别能够在多倍体、剂量敏感和环境依赖的作物中提供稳定、田间相关表现的靶标。现有研究和综述已总结了CRISPR/Cas工具、编辑平台和基因组编辑在小麦中的应用，但较少关注胁迫相关靶标的翻译就绪度（translational readiness）。需要更有用的框架来评估靶标在生物学上是否合适、剂量兼容、性状相关、环境稳定，以及可在育种计划中部署。本综述从面向翻译的视角评估CRISPR/Cas介导的小麦干旱、高温和盐碱抗性改良。研究人员考察了多倍性、同源等位基因剂量、性状复杂性、环境相互作用、转化背景和育种背景如何影响编辑结果。根据编辑策略、生理相关性、农艺效应、验证深度和田间证据比较代表性靶标-编辑配置。然后操作化了一个CRISPR翻译就绪度框架，对因果证据、编辑方向、同源等位基因分辨率、农艺可预测性、验证水平和育种可部署性进行评分。通过区分探索性、发展性和高级配置，该综述为优先考虑剂量感知、可田间测试和育种兼容的干预措施以促进气候适应性小麦改良提供了基础。

**2. Literature search and evidence classification**
本综述进行了结构化文献检索，以识别与CRISPR/Cas介导的小麦干旱、高温和盐碱抗性改良相关的研究。检索了Web of Science、Scopus、PubMed和Google Scholar自建库以来的文献。检索词组合了“wheat”或“Triticum aestivum”与“CRISPR”、“Cas9”、“Cas12a”、“genome editing”、“base editing”、“prime editing”、“promoter editing”或“homoeolog-specific editing”，以及胁迫相关术语如“drought”、“water deficit”、“heat”、“high temperature”、“salinity”、“salt stress”、“abiotic stress”、“root architecture”、“ion homeostasis”和“thermotolerance”。还检查了相关原始文章和综述的参考文献列表以识别额外的小麦特异性研究。优先考虑报告了胁迫相关基因在小麦中的基因组编辑、功能表征、自然等位变异或农艺评价的原始研究。仅当模型植物或其他作物的研究提供了小麦中尚未有的必要机制或技术背景时，才将其纳入。如果文章仅关注生物胁迫、籽粒质量或编辑工具开发而不涉及非生物胁迫靶标选择、剂量控制或育种部署，则被排除。综述用于建立更广泛的背景，但不作为分配靶标就绪度的主要证据。证据分为五个水平：关联证据（association evidence）包括胁迫响应表达、数量性状位点（QTL）、全基因组关联信号、单倍型和预测的分子相互作用。功能小麦证据（functional wheat evidence）包括过表达、RNA干扰、病毒诱导的基因沉默、诱导或自然突变体、互补和生化验证。直接编辑证据（direct editing evidence）需要分子确认的编辑小麦植株，具有可识别的突变和同源等位基因配置。改良导向编辑证据（improvement-oriented editing evidence）要求编辑的等位基因增强相关胁迫表型，且无已确立的主要发育惩罚。农艺证据（agronomic evidence）包括生殖阶段评估、产量组分测量、在精英或适应性种质中的评价，以及田间或多环境测试。自然或渐渗等位基因的田间表现与CRISPR衍生品系的田间评价分开记录。对于每个代表性靶标，提取了关于基因功能、胁迫组分、编辑策略、突变类型、A、B、D基因组配置、受体基因型、发育阶段、胁迫处理、生理结果、非胁迫效应、生殖或产量表现以及田间验证状态的信息。保留相互矛盾、中性和有害的发现，以避免仅基于有利结果优先考虑靶标。这种结构化的证据分类为比较分析和就绪度评估提供了基础。

**3. Why abiotic stress resilience is difficult to engineer in wheat**
在小麦中工程化非生物胁迫抗性很困难，因为干旱、高温和盐碱响应受到多倍体基因组结构、同源等位基因剂量、发育阶段、遗传背景和环境变异的影响。与某些抗病性或籽粒质量性状不同，这些响应是数量性状且生理复杂。因此，挑战在于设计在胁迫强度、发育阶段、遗传背景和田间环境中保持有益的编辑，从靶标发现到在适应性品种中部署。3.1节讨论了多倍体基因组结构、泛基因组资源和同源等位基因冗余。面包小麦是异源六倍体物种，具有A、B和D亚基因组。大多数基因有三个同源拷贝，这种三倍化可以通过功能冗余、表达差异或部分补偿来补偿一个拷贝的功能丧失。因此，表型后果由被修饰的靶标基因和亚基因组拷贝决定。染色体尺度的中国春参考基因组建立了亚基因组分辨的基因注释、同源等位基因分配、调控分析和胁迫响应表达谱框架。但单一参考基因组无法捕捉全球种植小麦中的大量序列、基因含量和结构变异。多基因组组装和泛基因组资源揭示了中国春中不存在的染色体重排、渐渗、拷贝数变异、存在/缺失变异和育种相关单倍型，表明候选基因和调控区域在不同品种间可能差异很大。整合参考基因组、泛基因组、单倍型图谱、转录组图谱和结构变异数据集可以确定靶标是否保守、特定同源等位基因是否主导胁迫响应，以及有利等位基因是否已存在于适应性种质中。它们还支持用于同时同源编辑的保守引导RNA或用于选择性修饰的亚基因组特异性引导RNA。由于靶标位点多态性、拷贝数变异和结构重排可能降低引导效率或产生脱靶位点，基于单一参考基因组的引导设计可能不足以用于精英或区域适应性品种。同源等位基因冗余可能缓冲部分编辑，而同时破坏所有拷贝可增强表型但增加发育或生理惩罚。这种风险对于嵌入调控网络的胁迫响应基因尤其相关。表达优势或亚功能化可进一步导致A、B、D基因组拷贝对同一表型贡献不均。因此，看似等效的同源编辑可能产生不同结果。靶标优先考虑应考虑预期育种背景中的拷贝数、同源表达、序列保守性、自然变异和功能贡献。3.2节讨论了基因剂量和多效性权衡。基因剂量是小麦编辑结果的主要决定因素。表型可能因修饰了一个、两个还是三个拷贝而异。对于某些靶标，随着额外同源等位基因被破坏，表型效应增加，但更强的编辑并不总是等同于更好的农艺表现。完全破坏剂量敏感基因可能导致多效性效应、结构改变、生长减少或产量惩罚。这对胁迫相关转录因子、激酶、磷酸酶、激素信号元件和离子转运蛋白尤其重要，因为它们在相互连接的网络中工作。完全敲除可能改善一个胁迫标记，同时削弱非胁迫或波动条件下的生长、生殖发育或恢复。因此，最佳表型可能介于野生型活性和完全敲除之间。面向翻译的评估应尽可能比较单、双和三同源等位基因配置。对于剂量敏感基因，部分同源破坏、启动子编辑、顺式调控修饰、等位替换或蛋白质活性的精确改变可能优于完全敲除。应通过比较替代配置来实验测试同源等位基因剂量，以确定在改善抗性而不损害生长或生殖的基因活性水平。3.3节讨论了性状复杂性和基因型×环境相互作用。干旱、高温和盐碱耐受性不是单一性状。每种胁迫涉及多个生理和发育组分，这些组分随时间变化且随环境变化。干旱耐受性取决于根系构型、水分吸收、气孔调节、渗透调节、碳分配、生殖稳定性和胁迫后恢复。发育阶段在高温耐受性中起重要作用，生殖和籽粒灌浆阶段通常非常敏感。盐碱耐受性涉及渗透调节、Na⁺排斥、离子区隔化、组织耐受性和离子胁迫下的生长维持。某些响应可能代表胁迫避免或生长抑制而非生产性抗性。因此，有用的编辑必须平衡保护、生长、生殖和恢复。基因型×环境相互作用进一步使靶标评估复杂化。编辑等位基因的影响可能因土壤质地、持水量、蒸汽压差、养分有效性、盐分分布、胁迫时序和多重胁迫暴露而改变。遗传背景可通过物候、根系构型、产量潜力和补偿途径的差异进一步修改编辑结果。因此，靶标价值应通过一致的胁迫效益而无不可接受的生长、生殖或产量惩罚来判断。3.4节讨论了受控环境验证和田间表现不确定性。当前小麦基因组编辑研究的一个主要限制是经常依赖实验室或温室验证。受控环境有助于验证基因功能，但也可能过度简化植物在农业系统中面临的胁迫条件。干旱试验可能无法再现渐进性土壤干旱，高温处理可能忽略生殖阶段热浪，水培盐碱试验可能无法捕捉田间土壤中的异质盐分积累。因此，如果使用叶绿素保留、相对含水量、抗氧化活性、脯氨酸浓度、电解质泄漏或地上部Na⁺积累来替代生殖成功、籽粒数、籽粒重量和产量稳定性，则存在高估翻译价值的风险。积极的生理响应也可能掩盖延迟发育、减少生物量、恢复不良或产量惩罚，这些只有在完整作物周期中才会显现。相对较少的编辑小麦品系从分子确认和受控环境表型分析进展到生殖阶段评估、产量测量和多环境田间评价。验证应包括确认突变和同源等位基因配置、评估相关胁迫强度和发育阶段、评估胁迫和非胁迫下的全周期表现，以及在农艺相关背景下的多季节或多地点评价。没有这样的验证，编辑靶标仍具有翻译不确定性。3.5节讨论了育种背景、转化背景和可部署性。传统上，小麦的干旱、高温和盐碱耐受性通过表型选择、适应性品种杂交、轮回选择以及从地方品种或野生近缘种渐渗来增强。这些方法可以捕捉多基因适应和先前未表征的等位基因，但进展通常缓慢，因为胁迫表型环境变异大，且有利等位基因可能与不良连锁区域一起遗传。数量性状位点定位和标记辅助选择可用于转移大效应位点，而基因组选择可用于从全基因组标记效应预测复杂表现。然而，对于小的、环境依赖的效应和测量不一致的性状，其效率下降。CRISPR/Cas编辑可与这些育种方法并行使用，而非替代它们。然而，编辑的等位基因必须与合适的多基因背景结合，并通过杂交、选择和多环境测试进行评估，因为单一编辑无法补偿不良适应或产量潜力。小麦基因组编辑仍受转化和再生限制。大多数成功研究使用转化响应品种如Fielder或Bobwhite，因为精英和区域适应性品种通常更难转化。因此，在可转化基因型中开发的等位基因在转移到精英种质后可能因遗传背景效应、上位性或改变的胁迫响应网络而表现不同。因此，育种可部署性应作为靶标优先考虑的早期标准。

**4. Evolution of wheat improvement and CRISPR editing strategies: matching genetic intervention to trait architecture**
小麦改良已从表型选择和常规杂交发展到分子育种、基因工程和可编程基因组编辑。CRISPR/Cas系统现在使不同的突变类型和同源等位基因配置能够匹配靶标功能和剂量要求。4.1节讨论了从常规育种和基因工程到可编程基因组编辑的演变。常规小麦改良主要基于表型选择、杂交、轮回选择和从适应性品种、地方品种和野生近缘种渐渗，但受限于长育种周期、连锁累赘、某些位点周围有限的重组，以及低遗传力胁迫性状的选择困难。虽然突变育种增加了等位多样性，但突变是随机的，需要大量筛选以消除不良背景变异。标记辅助选择支持大效应位点，而基因组选择捕捉累积小效应；然而，两者都选择现有变异，而非创建定义的核苷酸或同源特异性变化。转基因过表达和RNA干扰实现了胁迫响应通路的直接操作，并为转录因子、离子转运蛋白、渗透调节剂和抗氧化系统提供了重要的功能证据。其缺点是随机整合、可变拷贝数、位置效应、非天然表达、外源DNA保留以及同源等位基因的不完全或可变抑制。序列特异性核酸酶的发展，特别是锌指核酸酶和转录激活因子样效应核酸酶，是向靶向基因组工程的重要一步。它们证明了可修饰定义的小麦位点和多个同源等位基因，但靶标特异性蛋白质工程限制了可扩展性和多重性。CRISPR/Cas系统通过可编程引导RNA促进了靶标识别过程，使同时修饰A、B、D基因组拷贝、多个基因或几个调控元件变得更加可行。CRISPR/Cas的主要优势是可以在完全敲除、选择性同源破坏、多重通路编辑、启动子修饰、精确核苷酸替换、转录激活或抑制，以及甚至潜在的等位替换之间进行选择。这种灵活性允许干预措施匹配靶标生物学，而非强加统一的丧失功能策略。4.2节讨论了用于敲除、同源破坏和多重编辑的Cas9和Cas12a。CRISPR/Cas9仍然是小麦中最流行和最成熟的基因组编辑平台。其高编辑效率、相对简单的引导设计以及与多重编辑的兼容性使其特别适用于靶向A、B和D亚基因组中的同源基因拷贝。基于Cas9的编辑在丧失功能产生清晰表型的性状上特别成功，如通过TaMLO编辑获得白粉病抗性、通过TaGW2修饰籽粒大小，以及涉及醇溶蛋白或淀粉生物合成基因的质量相关性状。然而，对于非生物胁迫抗性，Cas9介导的敲除的有用性强烈依赖于靶标生物学。当靶标是胁迫耐受性的负调节因子或减少基因功能产生可预测的生理优势时，敲除编辑可能合适。因此，敲除可能验证功能而不提供改良导向的等位基因。然而，敲除正调节因子或剂量敏感调节因子可能提供因果证据而不产生有利等位基因；因此，Cas9破坏不应是所有胁迫相关靶标的默认策略。Cas12a提供了互补替代方案，因为它识别富含T的PAM序列，产生交错双链断裂，并可通过更简单的crRNA阵列处理支持多重编辑。这些特征，连同识别扩展PAM的变体，拓宽了可编辑序列空间，并可能促进Cas9兼容位点有限的同源特异性、启动子或多重设计。目前，Cas12a是用于Cas9难以访问的靶标或多重配置的互补系统，因为性能随核酸酶变体、构建体架构、靶标序列、递送和温度而变化。4.3节讨论了实践中的剂量感知和同源特异性编辑。小麦剂量配置可通过单、双和三同源编辑实验比较。TaGW2编辑系列提供了有用的小麦特异性原理演示。不同A、B、D基因组拷贝中的突变在籽粒相关性状上产生了同源依赖和累积效应，表明编辑额外拷贝可增强表型，但单个同源可能贡献不均。虽然TaGW2不是胁迫靶标，但等效的剂量系列可确定胁迫调节因子的部分破坏是否比三同源敲除更好地保留生长和产量。当表达或功能证据表明一个亚基因组拷贝对表型贡献不成比例时，同源特异性编辑尤其合适。可针对同源特异性多态性设计引导RNA以修饰一个拷贝而保留其他拷贝，而当同时破坏在生物学上合理时，可使用保守引导RNA。4.4节讨论了用于定量调控的启动子、顺式调控和转录编辑。启动子和顺式调控编辑可修饰表达的量、时间或组织特异性，同时保留编码功能。最近一项小麦研究通过靶向Ppd-D1和Ppd-B1启动子中预测的转录因子结合位点证明了这一原理。不同的插入缺失改变了编辑同源等位基因的昼夜表达模式，并产生了抽穗期变异，包括在实验田间条件下提早抽穗。虽然Ppd-1主要是光周期调节因子，但该研究证明小麦启动子编辑可产生数量变异，且调控突变也可能改变株高和籽粒重量。病毒递送的引导RNA也已被用于产生小麦转录因子启动子中的可遗传缺失，以及进行农艺基因的多重编辑。CRISPR/dCas9系统提供了另一种形式的调控控制。催化失活的Cas9可融合到转录激活或抑制结构域，并引导至启动子区域而不产生永久双链断裂。在普通小麦中，基于dCas9的激活和抑制系统在稳定品系中改变了靶基因转录，且调控效应遗传给下一代。这些系统可在生成永久启动子等位基因之前测试部分上调或下调是否有益，但需要稳定的构建体表达，且田间水平的胁迫证据仍然有限。启动子靶标应由调控变异、转录因子结合、染色质可及性和胁迫响应表达指导，因为非靶向缺失可能产生不可解释的表达变化。4.5节讨论了用于精确等位基因工程的基础编辑和先导编辑。基础编辑和先导编辑可实现精确序列变化而无需常规双链断裂修复，尽管它们在小麦中的使用仍不如核酸酶介导的编辑广泛。胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器可修饰调控元件、重现有利等位基因或微调蛋白质活性。在小麦中，碱基编辑已被用于产生除草剂耐受性等位基因并拓宽可能的靶向修饰范围。对于胁迫抗性，碱基编辑在有利表型与已知核苷酸替换而非完全基因失活相关时最相关。它可重现胁迫适应性等位基因、改变关键氨基酸或调控基序，并实现同源特异性修饰。然而，小麦中的碱基编辑仍面临一些挑战，包括狭窄的编辑窗口、PAM依赖性、潜在的旁观者编辑，以及难以实现跨同源等位基因的所需编辑组合。因此，候选替换应基于遗传、生化或比较证据，而非仅因为它们被识别为技术上可编辑。先导编辑也可通过实现靶向替换、插入和缺失来扩展编辑范围，无需供体模板或典型的双链断裂。它可用于重现自然等位基因、编辑调控基序，或添加GWAS、泛基因组学或适应研究中发现的变体。尽管小麦中先导编辑的效率有所提高，但其在非生物胁迫抗性性状中的使用仍处于早期阶段。4.6节讨论了无DNA、病毒介导和减少组织培养的递送方法。稳定转化可引入载体序列并限制编辑到响应基因型，而无DNA方法减少转基因整合和随后的分离需求。预组装的Cas9-引导RNA核糖核蛋白复合物已被递送到小麦细胞中，以产生编辑植物而不稳定整合编辑构建体。其瞬时活性可能减少持续脱靶切割，但递送仍通常依赖于轰击、原生质体或组织培养，且再生具有基因型依赖性。病毒介导系统为将引导RNA递送到小麦组织中提供了替代途径。大麦条纹花叶病毒载体已在表达Cas9的小麦中产生可遗传突变、多重编辑和启动子缺失。还开发了病毒诱导的无转基因编辑策略，通过将病毒感染的Cas9表达植物的花粉与野生型小麦杂交，允许恢复编辑后代而不含Cas9转基因。这些系统避免了为每个引导RNA转化新构建体，但病毒宿主范围、感染效率、引导RNA移动性、生物安全性和对Cas9材料的依赖可能限制常规使用。形态发生调节因子和改进的再生系统提供了另一种增加可编辑小麦基因型范围的方法。GRF-GIF系统、TaWOX5介导的增强和其他促进再生的策略已改善了一些小麦背景中的转化响应。体内和减少组织培养的方法可能进一步缩短恢复过程并减少体细胞无性系变异。在精英和适应性小麦背景中的更广泛验证仍然必要。编辑策略应与靶标功能、所需同源等位基因剂量、因果证据和受体基因型相匹配。

**5. Component-based evaluation of CRISPR targets for wheat abiotic stress resilience**
小麦胁迫抗性的CRISPR靶标必须根据其产生稳定农艺效益的能力来判断，而不仅仅是表达、生存、抗氧化活性或渗透调节剂积累的变化。靶标价值取决于受影响的组分性状、所需的遗传改变方向、同源等位基因配置，以及在农艺相关条件下的验证。因此，证据被区分为直接编辑证据、来自转基因、沉默、突变体或互补的功能小麦证据，以及来自表达、QTL、GWAS、单倍型或生化研究的关联证据。功能和关联证据支持候选发现，但不证明所需的编辑可以在没有生长、生殖或产量惩罚的情况下产生。表2比较了主要靶标类别在干旱、高温、盐碱和交叉胁迫响应中的翻译优势、证据空白和当前就绪度水平。5.1节讨论了干旱抗性：协调水分获取、保存、生殖和恢复。干旱抗性整合了土壤水分获取、失水调节、细胞保护、生殖稳定性和胁迫后恢复。这些组分涉及权衡：更大的根系需要更多碳，气孔关闭减少光合作用，渗透调节可能无法维持籽粒设置，生长限制可能增加生存可能性但降低产量。因此，靶标应根据它们修饰的特定干旱组分进行评估。5.1.1节讨论了根系构型和土壤水分获取。可用于水分获取的土壤体积取决于根系深度、胚根伸长、根角、侧根分布、水力导度和根-冠分配。根发育基因是有吸引力的上游靶标，但最佳构型取决于土壤深度、降雨模式、养分分布和作物持续时间。深层根可能有助于终端干旱，而侧根增殖可能有助于利用间歇性地表水。一个最好的剂量感知例子是小麦12-氧代植物二烯酸还原酶亚家族III（OPRIII）基因，它们参与茉莉酸生物合成和根系构型。CRISPR/Cas9在单个重复OPRIII基因中的功能丧失突变增加了胚根长度，而增加剂量或组成型表达缩短了胚根，加速了侧根出现，并增加了茉莉酸积累。突变体产生大约17-28%更长的胚根，证明了部分多基因家族破坏的可测量效应。该研究还将OPRIII剂量与相关染色体工程品系在水分限制下的田间表现联系起来，尽管CRISPR突变体本身缺乏多环境产量验证。因此，OPRIII是一个强的剂量感知根靶标，但还不是田间验证的干旱等位基因。NAC转录因子也调节根生长和生物量分配。TaNAC69-1和TaNAC6-3B已与根发育、生物量调节和干旱响应相关联。由于其更广泛的功能也可能改变衰老、地上部生长或生殖分配，启动子调控或同源特异性修饰比三同源敲除更合理。评估应将根系构型与碳分配和籽粒产量联系起来，而非仅根大小。水通道蛋白和细胞壁松弛或根角调节因子仍主要是关联或转基因基础的候选；因果效应、同源贡献和碳成本仍未解决。5.1.2节讨论了气孔调节、ABA信号和水利用平衡。气孔行为平衡水分保存、碳同化和蒸腾冷却。ABA感知和信号涉及PYR/PYL受体、PP2C磷酸酶、SnRK2激酶和AREB/ABF转录因子，小麦候选包括TaPP2C、TaSnRK2和TaAREB/ABF家族成员。PP2C-A10已与萌发和干旱响应相关联，而TaSnRK2.10磷酸化下游干旱信号蛋白。由于这些基因也调节萌发、根、衰老和生殖，组成型ABA增强可能以碳增益为代价保存水分，而过度削弱可能加速脱水。因此，动态通路调控比最大激活更可取。一个直接的改良导向例子是TaATX4，一个ABA介导干旱响应的染色质相关负调节因子。CRISPR/Cas9编辑改善了干旱耐受性，表明去除已验证的负调节因子可增强小麦干旱响应。然而，其对不同干旱时序、强度和遗传背景下的产量影响仍未解决。广泛的调节因子如DREB、NAC和ERF蛋白整合ABA依赖和ABA非依赖通路。一个功能获得型DREB等位基因与改善的干旱耐受性相关联，而TaERF13-2B作为负调节因子。这些家族不应被统一对待：已验证的负调节因子可能适合敲除，而正调节因子更适合启动子或等位基因工程。5.1.3节讨论了渗透调节、细胞保护和氧化还原稳态。脯氨酸、可溶性糖、相容性溶质、抗氧化剂、脱水素、晚期胚胎发生丰富蛋白和膜保护系统有助于细胞水合和损伤限制。TaP5CS和TaP5CR调节脯氨酸生物合成，TaERF87-TaAKS1-TaP5CS1/TaP5CR1模块已与脯氨酸介导的干旱耐受性相关联。干旱