基于柔嫩艾美耳球虫EtAMA1和EtSAG13的重组亚单位疫苗免疫保护效力评价

《Poultry Science》：Evaluation of Immune Protective Efficacy of Recombinant Subunit Vaccines Based on Eimeria tenella EtAMA1 and EtSAG13

　　

禽球虫病是一种严重的寄生虫病，由艾美耳属（Eimeria）物种感染引起，其中柔嫩艾美耳球虫（E. tenella）是致病性最强的之一。本研究旨在评估基于E. tenella顶端膜抗原1（EtAMA1）和表面抗原13（EtSAG13）的重组亚单位疫苗候选物对鸡E. tenella感染的保护效力。为此，研究人员克隆了EtAMA1和EtSAG13基因，去除了编码预测信号肽和跨膜结构域的区域，优化了序列，并将片段插入pET-28a(+)载体。成功构建了重组亚单位疫苗候选物rEtAMA1、rEtSAG13和rEtAMA1-SAG13，并表达了相应的重组蛋白。随后进行了动物实验，评估不同剂量（50和100 μg）重组蛋白的免疫保护效果。结果显示，所有三种重组蛋白都能被感染E. tenella的鸡血清和实验室制备的多克隆抗体特异性识别。50 μg rEtAMA1-SAG13免疫组保护效果最好，抗球虫指数（ACI）为175.48，表明中等抗球虫效力。组织病理学分析进一步显示，免疫组盲肠病变显著减轻。此外，免疫组血清中特异性抗体（IgG和IgY）和细胞因子（IL-2、IL-6、IL-17和IFN-γ）水平显著高于未免疫组（P < 0.05）。总之，结合EtAMA1和EtSAG13的重组亚单位疫苗候选物对E. tenella感染提供了有效的免疫保护，有望用于鸡球虫病的预防和控制。

禽球虫病是由艾美耳属（Eimeria）寄生虫引起的严重原生动物疾病，其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella, E. tenella）是致病性最强的物种之一，导致鸡群高发病率、严重出血、腹泻甚至死亡，全球家禽业每年经济损失高达140亿美元。长期以来，鸡球虫病的防控主要依赖抗球虫药物，但长期大量使用导致球虫耐药性日益突出，且抗生素使用限制日益严格，促使开发新策略。活疫苗虽有效，但存在毒力回复、病原体排入环境的风险及生产成本高等缺点。因此，基因工程疫苗，尤其是重组亚单位疫苗，因其高安全性、良好稳定性和适合大规模生产而备受关注。E. tenella的顶端膜抗原1（EtAMA1，一种微线体蛋白家族成员，参与寄生虫入侵宿主细胞）和表面抗原13（EtSAG13，表面抗原家族蛋白，参与黏附与入侵）在孢子体和裂殖体阶段表达，具有良好免疫原性，但单一抗原亚单位疫苗保护效果有限。为此，研究人员将EtAMA1和EtSAG13联合构建多抗原重组亚单位疫苗，系统评估其免疫保护效果。该研究发表于《Poultry Science》。

研究人员开展了以下研究：首先克隆EtAMA1和EtSAG13基因，去除信号肽和跨膜区，优化序列后插入pET-28a(+)载体，构建重组质粒，在BL21(DE3)中表达并纯化得到rEtAMA1、rEtSAG13和rEtAMA1-SAG13三种重组蛋白。通过Western blot验证其抗原性与免疫反应性。随后进行动物实验：将14日龄SPF鸡随机分为8组（每组20只），包括未免疫未攻毒组（K）、未免疫攻毒组（G）以及不同剂量（50 μg和100 μg）的rEtAMA1、rEtSAG13和rEtAMA1-SAG13免疫攻毒组。免疫方案为14日龄和21日龄颈部皮下注射，28日龄口服5×10⁴个孢子化卵囊攻毒。攻毒后7天评估平均增重、相对增重率、盲肠病变评分、卵囊排出量（OPG）、抗球虫指数（ACI），并取盲肠组织进行苏木精-伊红（HE）染色组织病理学观察。同时采集血清，用ELISA检测特异性抗体IgG、IgY及细胞因子IL-2、IL-6、IL-17、IFN-γ水平。主要技术方法涉及基因克隆与质粒构建、原核表达与纯化、Western blot、动物免疫与攻毒实验、组织病理学、ELISA检测，样本来源包括1日龄SPF雏鸡（购自康姆农场，山西农业大学实验动物中心饲养）和2月龄新西兰白兔（购自北京百尔康耐特实验兔养殖生物技术发展有限公司，山西农业大学实验动物中心饲养）。

**结果**：

**Gene Cloning and Plasmid Construction**：以E. tenella孢子体cDNA为模板，成功扩增EtAMA1（1608 bp）和EtSAG13（732 bp）基因片段，预测信号肽和跨膜区后优化序列，构建重组质粒pET-28a(+)-EtAMA1-SAG13，经双酶切验证获得约1998 bp插入片段。

**Expression and Identification of Recombinant Proteins**：利用His标签小鼠单克隆抗体进行Western blot，rEtAMA1、rEtSAG13和rEtAMA1-SAG13均被特异性识别，证实重组蛋白成功表达。

**Identification of Antigenicity and Immunoreactivity of the Recombinant Proteins**：三种重组蛋白与E. tenella感染鸡阳性血清和实验室制备的兔多克隆抗体反应，产生特异性条带（约58、32、73 kDa），而与阴性血清无反应，表明具有良好的抗原性和免疫反应性。

**Evaluation of Protective Efficacy**：与未免疫攻毒组（G）相比，所有免疫攻毒组平均增重、相对增重率、病变减轻率和卵囊减少率显著提高，病变评分和OPG显著降低（P<0.05）。其中50 μg rEtAMA1-SAG13组（AS50）表现最佳：相对增重率89.48%，卵囊减少率79.36%，抗球虫指数（ACI）为175.48，达到中等抗球虫效力，优于其他免疫组。

**Histopathological Observation**：HE染色显示，K组盲肠黏膜结构完整；G组严重病变，上皮坏死脱落，腺体破坏，大量不同发育阶段虫体，炎性细胞浸润和出血；免疫组病变减轻，其中AS50组盲肠黏膜和腺体结构相对完整，出血轻微，仅见零星卵囊，表明免疫显著减轻盲肠病理损伤。

**Analysis of Immune Response**：ELISA检测显示，所有免疫组在加强免疫前和攻毒前血清IgG、IgY水平显著高于G组（P<0.05），AS50组升高最明显；细胞因子IL-2、IL-6、IL-17、IFN-γ水平在免疫后显著升高，加强免疫前和攻毒前进一步升高，AS50组始终最高（P<0.05），表明重组蛋白有效诱导了细胞和体液免疫应答，以细胞免疫为主。

**讨论与结论**：讨论部分指出，E. tenella感染导致盲肠结构损伤，而重组蛋白免疫可减轻病变，其中50 μg rEtAMA1-SAG13效果最佳，与近期研究（如rEtMIF疫苗）一致，表明优化剂量和联合抗原策略可增强保护。血清抗体和细胞因子水平升高提示重组蛋白激发了Th1/Th2混合型免疫应答。结论部分翻译如下：总之，成功构建了携带E. tenella EtAMA1和EtSAG13的原核表达载体，纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。动物攻毒实验进一步表明，50 μg rEtAMA1-SAG13免疫组获得175.48的ACI，显示中等抗球虫效力，且保护效果优于单抗原组。这些发现表明，这种多抗原重组亚单位疫苗策略有助于减轻E. tenella感染的病理效应，并为禽球虫病的预防和控制提供了一种有前景的候选途径。