支原体污染改变人类先天免疫细胞促炎细胞因子的表达谱

《Cell Biochemistry and Function》：Mycoplasma Contamination Alters the Expression Profile of Pro-Inflammatory Cytokines by Human Innate Immune Cells

　　

支原体（Mycoplasma）污染对体外测试系统的影响已被广泛讨论，体外研究已证明其对受污染细胞系的生理学产生多种影响。迄今为止，关于生物活性物质（如受污染细胞系中产生的病毒）对原代免疫细胞的影响知之甚少。因此，本研究的目的是精确确定支原体污染对人类先天免疫细胞的影响。为此，研究人员从健康供体体外分化出髓样树突状细胞（myeloid dendritic cells, mDC）和两种类型的巨噬细胞（M1型和M2型），并用不同体积的来自支原体污染的VeroE6细胞（SN(M)）的细胞培养上清液进行处理。根据细胞类型，支原体污染介导了细胞活力的下降和免疫细胞的预激活。令人惊讶的是，少量SN(M)就足以诱导大量促炎性白细胞介素（interleukin, IL）-6的分泌，以及较小程度的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α和白细胞介素（IL）-10。此外，SN(M)与多种Toll样受体（toll-like receptor, TLR）配体和不同RNA编码病毒共同刺激细胞，会根据所分析标志物、细胞类型和刺激物差异性地改变其活化状态。而且，SN(M)共同处理强烈影响了mDC以及M1和M2巨噬细胞在多种刺激物（尤其是病毒感染）下诱导的细胞因子谱。与此一致，在支原体污染的VeroE6细胞中产生的一批严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2₂）诱导了高水平的IL-6和TNF-α，而未受污染的病毒原液处理则未导致细胞因子表达。研究人员的數據表明，支原体污染对使用人类免疫细胞的感染实验的实验结果有重大影响，因此可能导致实验数据的误解。

支原体污染改变人类先天免疫细胞促炎细胞因子的表达谱：一项比较分析

**研究背景与问题**
支原体（Mycoplasma）是一类缺乏细胞壁、可自我复制的微小微生物，常见于细胞培养污染中。已有研究证实支原体污染对细胞系生理学的影响，如改变宿主基因表达、竞争培养基资源、降解宿主DNA等。然而，关于支原体污染对原代免疫细胞（尤其是人类先天免疫细胞）的影响仍知之甚少。特别是，生物活性物质（如病毒或细胞因子）常在细胞系中生产，若这些细胞系受支原体污染，则其产物可能携带支原体成分，从而干扰免疫细胞实验的结果。现有研究主要集中于小鼠或猪源免疫细胞，对人类先天免疫细胞的系统性比较分析尚属空白。因此，该研究旨在探究支原体污染对多种人类先天免疫细胞（包括髓样树突状细胞（mDC）、M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞）的活力、活化状态及细胞因子产生的影响，并评估其在多种刺激（包括TLR配体和病毒感染）下的协同效应，尤其是SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）感染实验中的潜在干扰。

**研究内容与结论**
研究人员从健康供体（德国红十字会献血中心，法兰克福）来源的血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs），并体外分化出mDC、M1和M2巨噬细胞。通过使用支原体污染的VeroE6细胞上清（SN(M)）模拟生物活性物质中的污染，对上述细胞进行不同体积处理，并分析其活力、活化标志物（CD40、CD80、CD83、CD86、MHC-II）及细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-10等）的表达。此外，在TLR配体（如LPS、CpG2216、Flagellin、poly(I:C)、R848、Pam3Cys）和RNA病毒（水疱性口炎病毒VSV、裂谷热病毒RVFV、托戈托病毒Thov、甲型流感病毒PR8）刺激下，评估SN(M)的共处理效应。最后，将SARS-CoV-2分别接种于支原体污染和未污染的VeroE6细胞，比较两种病毒原液对免疫细胞的影响。

研究结论表明，即使极低体积的SN(M)（1-50 μL）也能显著降低mDC和M2巨噬细胞的活力，并诱导M2巨噬细胞活化标志物（CD40、CD80、CD83）上调。更重要的是，SN(M)单独处理即可触发大量促炎细胞因子IL-6的分泌，以及TNF-α和IL-10的表达。在TLR配体或病毒共刺激下，SN(M)进一步改变了细胞因子谱，尤其是增强了多种刺激（如CpG2216、Poly(I:C)、RVFV、Thov、PR8）诱导的IL-6产生。特别值得注意的是，在支原体污染细胞中生产的SARS-CoV-2原液（SARS-CoV-2 (+M)）感染mDC、M1和M2巨噬细胞后，诱导了高水平的IL-6和TNF-α，而未受污染的病毒原液（SARS-CoV-2 (?M)）则无此效应。该研究首次对人类先天免疫细胞进行了比较分析，强调支原体污染可严重干扰感染实验的结果，导致数据误读，因此需要定期筛查以确保实验准确性。

**主要技术方法**
研究使用的主要关键技术包括：从健康供体（德国红十字会献血中心）外周血分离PBMCs并分选单核细胞，通过添加GM-CSF+IL-4、GM-CSF或M-CSF体外分化mDC、M1和M2巨噬细胞；制备支原体污染的VeroE6细胞上清（SN(M)）并通过VenorGeM Classic PCR确认污染（检测限10 CFU/mL）；将SN(M)以不同体积（0.05-50 μL/mL）处理细胞，并采用流式细胞术分析细胞活力及活化标志物（CD40、CD80、CD83、CD86、MHC-II）表达；使用LEGENDplex多因子检测和ELISA测定细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-10等）；在TLR配体（Pam3Cys、poly(I:C)、LPS、Flagellin、R848、CpG2216）及RNA病毒（VSV、RVFV、Thov、PR8）刺激下评估SN(M)的共处理效应；将SARS-CoV-2（分离株MUC IMB-1）在污染或未污染的VeroE6细胞中扩增，并以MOI 0.01或0.1感染免疫细胞。

**研究结果**

**3.1 与支原体污染细胞培养上清孵育改变人类先天免疫细胞的活化状态和细胞因子谱**
通过流式细胞术分析，发现高体积（50 μL）SN(M)显著降低mDC和M2巨噬细胞的活力，而M1巨噬细胞活力未受影响。活化标志物检测显示，M2巨噬细胞在50、5、1 μL SN(M)处理后CD40、CD80、CD83上调，但CD86下调；mDC和M1巨噬细胞仅在高剂量下出现CD80、CD83、CD86的轻微上调。细胞因子分析表明，50、5、1 μL SN(M)即可诱导mDC、M1和M2巨噬细胞大量分泌IL-6，以及较低水平的TNF-α和IL-10，其中M2巨噬细胞产生的IL-6最高。

**3.2 支原体污染改变多种刺激诱导的先天免疫应答**
在TLR配体或病毒共刺激下，SN(M)进一步降低了部分处理的细胞活力（如CpG2216和Thov共处理显著降低mDC、M1、M2活力；VSV感染本身导致强细胞病变）。活化标志物分析显示，SN(M)单独处理即可上调相关标志物，但共刺激后未进一步增强；然而，M2巨噬细胞中CD40表达在多种处理（如Flagellin、Poly(I:C)、病毒）下因SN(M)存在而显著上调。细胞因子谱表明，SN(M)共处理显著增强了多种刺激诱导的IL-6表达（如LPS、CpG2216、Flagellin、Poly(I:C)、RVFV、Thov、PR8），尤其在无SN(M)时这些刺激不诱导IL-6。TNF-α和IL-10亦呈现类似趋势，但RVFV和Thov感染下M1巨噬细胞的IL-10产生因SN(M)共处理而显著降低。

**3.3 在支原体污染VeroE6细胞中生产的SARS-CoV-2原液（而非无支原体SARS-CoV-2）诱导高表达促炎IL-6和TNF-α**
通过ELISA检测，发现SARS-CoV-2 (+M)（MOI 0.01或0.1）感染mDC、M1和M2巨噬细胞后，显著诱导IL-6和TNF-α表达，且呈剂量依赖性；而SARS-CoV-2 (?M)感染后未检测到细胞因子表达。该效应与SN(M)单独处理（50 μL）诱导的IL-6水平相当，表明支原体污染是导致细胞因子升高的重要原因。

**讨论与结论**
讨论部分指出，支原体污染可通过TLR2/TLR6识别MALP-2（一种支原体来源的脂肽）激活Nf-κB和MAP激酶通路，从而诱导免疫细胞活化。本研究首次系统比较了多种人类先天免疫细胞对支原体污染上清的反应，证实极低剂量污染即可引发强烈IL-6反应，并干扰后续刺激（包括TLR配体和病毒）诱导的免疫应答。在SARS-CoV-2实验中，污染病毒原液诱导的细胞因子谱与干净病毒截然不同，直接证明了支原体污染对病毒实验结果的误导性。此外，共处理中某些细胞因子（如RVFV/Thov诱导的M1巨噬细胞IL-10）的降低提示支原体具备免疫调节作用，可能涉及先天免疫重编程或交叉耐受机制。研究结论翻译如下：

总之，本研究首次提供了支原体污染细胞系来源的上清液处理不同类型人类先天免疫细胞反应比较分析。研究人员的发现揭示了，在多种刺激物处理及病毒感染下，极低量的支原体污染上清足以改变人类先天免疫细胞的活化状态和诱导的细胞因子谱。值得注意的是，少量支原体的存在导致大量细胞因子（尤其是IL-6）的产生。除直接免疫刺激效应外，这些发现表明支原体能够以环境依赖方式调节先天免疫应答。此类效应与先天免疫重编程和异源启动的概念一致，并在更广泛意义上可能与训练免疫机制相关，其中先前或同时的刺激影响后续无关刺激的反应。相反，在多种TLR配体或病毒感染共处理后未观察到细胞因子增强，可能反映了模式识别受体通路之间的免疫耐受或交叉耐受。这些观察结果强调了支原体在塑造先天免疫应答中的更广泛作用，不仅仅限于简单的细胞因子诱导。这些数据强调了对支原体污染进行定期筛查的重要性，以检测并最终预防污染，从而确保实验数据的准确性和可靠性。