《Chemistry & Biodiversity》：Dicentrine, an Aporphine Alkaloid From Ocotea langsdorffii, Induces Mitochondrial Dysfunction and Oxidative Stress in Leishmania (L.) infantum
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中文摘要翻译：从Ocotea langsdorffii中分离的阿朴啡类生物碱Dicentrine，研究人员评估了其对婴儿利什曼原虫（L.）infantum、亚马逊利什曼原虫（L.）amazonensis和巴西利什曼原虫（V.）braziliensis的体外抗利
中文摘要翻译：从Ocotea langsdorffii中分离的阿朴啡类生物碱Dicentrine，研究人员评估了其对婴儿利什曼原虫（L.）infantum、亚马逊利什曼原虫（L.）amazonensis和巴西利什曼原虫（V.）braziliensis的体外抗利什曼活性。在鼠腹膜巨噬细胞中评估了细胞毒性，并通过评估线粒体膜电位（ΔΨm）、活性氧（ROS）产生和质膜完整性，在婴儿利什曼原虫（L.）infantum前鞭毛体中研究了其作用机制。Dicentrine对前鞭毛体和细胞内无鞭毛体形式表现出强效活性，EC50值范围为0.86至1.64 μg/mL。该化合物对巨噬细胞表现出低细胞毒性（CC50 = 162.5 μg/mL），从而产生高选择性指数（最高达188.3）。机制研究显示，ΔΨm显著破坏以及ROS产生呈剂量依赖性增加，表明线粒体功能障碍和氧化应激是寄生虫死亡的关键事件。这些发现凸显了dicentrine作为抗利什曼药物开发的有前景的先导化合物。
论文解读文章：
**研究背景与问题**
利什曼病是一种被忽视的热带寄生虫病，由利什曼原虫属（Leishmania）的原生动物寄生虫引起，通过受感染的雌性白蛉叮咬传播给哺乳动物。该病主要有三种临床形式：皮肤型、黏膜型和内脏型利什曼病（VL），其中内脏型最为严重，若不治疗，2年内死亡率可高达95%。在巴西，内脏型利什曼病主要由婴儿利什曼原虫（L. (L.) infantum）引起，而皮肤黏膜型则由巴西利什曼原虫（L. (V.) braziliensis）、亚马逊利什曼原虫（L. (L.) amazonensis）等物种引起。目前的标准治疗药物包括五价锑剂、喷他脒、两性霉素B和米替福新，但这些药物存在毒性大、疗程长、费用高以及耐药性出现等问题，因此亟需开发更安全有效的替代药物。天然产物尤其是生物碱类化合物，是抗寄生虫药物发现的重要来源。此前研究表明，樟科（Lauraceae）植物尤其是Ocotea属中的阿朴啡类生物碱具有抗利什曼活性。研究人员前期从Ocotea puberula中分离出dicentrine，发现其具有抗利什曼特性并影响质膜的热力学和力学性质，但针对内脏化物种婴儿利什曼原虫的作用及其对寄生虫生物能量学的深入影响尚未被探索。此外，Ocotea langsdorffii这一巴西特有物种的植物化学研究尚属空白。因此，本研究旨在首次从O. langsdorffii中分离dicentrine，系统评估其对三种利什曼原虫的体外活性，并深入探究其作用机制。
**研究内容与结论**
研究人员从O. langsdorffii的枝条中通过生物活性引导的分离纯化获得高纯度（99%）的dicentrine，并通过ESI-HRMS、NMR和旋光度等光谱技术确认结构。随后评估了该化合物对婴儿利什曼原虫、亚马逊利什曼原虫和巴西利什曼原虫前鞭毛体及细胞内无鞭毛体的活性，测定了对鼠腹膜巨噬细胞的细胞毒性，并计算选择性指数（SI）。在机制研究方面，以婴儿利什曼原虫前鞭毛体为模型，通过JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（ΔΨm），使用H2DCFDA探针检测活性氧（ROS）水平，并通过碘化丙啶（PI）摄取实验评估质膜完整性。研究结果表明，dicentrine对三种利什曼原虫前鞭毛体均表现出显著的抗利什曼活性，EC50值分别为1.64、0.95和0.86 μg/mL，虽然两性霉素B（AmpB）的EC50值更低（0.13–0.25 μg/mL），但dicentrine的细胞毒性极低（CC50 = 162.5 μg/mL），而AmpB的CC50仅为0.79 μg/mL，因此dicentrine的选择性指数（SI）高达99.1–188.3，远优于AmpB（SI为3.2–6.1）。在感染巨噬细胞模型中，dicentrine以剂量依赖性方式显著降低感染巨噬细胞百分比和细胞内无鞭毛体数量，在4 μg/mL浓度下对婴儿利什曼原虫的感染率降低60.85%，无鞭毛体减少65.95%，效果与1 μg/mL的AmpB相当或更优。机制研究表明，dicentrine显著降低ΔΨm（呈剂量依赖性），同时诱导ROS水平大幅升高（分别增加183.88%和212.46%），但未破坏质膜完整性，表明其通过诱导线粒体功能障碍和氧化应激导致寄生虫死亡，而非坏死途径。该研究首次报道了dicentrine在O. langsdorffii中的存在，并揭示了其针对内脏利什曼病原虫的机制，为开发新型抗利什曼药物提供了有前景的先导化合物。
**主要技术方法**
本研究采用以下关键技术方法：（1）植物材料采集与生物碱提取：于2022年4月在巴西米纳斯吉拉斯州Santana do Riacho采集O. langsdorffii枝条，经脱脂、碱化、二氯甲烷萃取、酸化和再萃取获得生物碱粗提物，再通过硅胶柱层析进行生物活性引导的分离纯化。（2）结构鉴定：利用高效液相色谱（HPLC）检测纯度，电喷雾高分辨质谱（ESI-HRMS）、核磁共振（NMR）和旋光度确定化合物结构。（3）抗利什曼活性测定：采用MTT法测定前鞭毛体EC50，用感染巨噬细胞模型评估对细胞内无鞭毛体的效果，以两性霉素B为阳性对照。（4）细胞毒性评估：使用鼠腹膜巨噬细胞测定CC50并计算选择性指数。（5）机制研究：采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（ΔΨm），H2DCFDA探针检测ROS水平，PI摄取实验评估质膜完整性。所有实验均使用标准利什曼原虫株（L. (L.) infantum MHOM/BR/1970/BH46等），动物实验经伦理委员会批准。
**结果部分**
**2.1 Dicentrine的化学表征**：从O. langsdorffii中分离得到dicentrine，纯度为99%，ESI-HRMS显示[M+H]+和[M+Na]+离子峰分别为m/z 340.1552和362.1371，与分子式C20H21NO4一致，NMR和旋光数据与文献报道相符。
**2.2 Dicentrine对利什曼原虫的体外活性**：通过MTT法测定，dicentrine对婴儿利什曼原虫、亚马逊利什曼原虫和巴西利什曼原虫前鞭毛体的EC50值分别为1.64、0.95和0.86 μg/mL，而AmpB的EC50分别为0.13、0.25和0.20 μg/mL。细胞毒性实验显示dicentrine的CC50为162.5 μg/mL，AmpB为0.79 μg/mL，因此dicentrine的选择性指数（SI）分别为99.1、171.7和188.3，远高于AmpB的6.1、3.2和4.0，表明其具有优异的选择性。
**2.3 Dicentrine减少巨噬细胞感染**：在感染亚马逊利什曼原虫的巨噬细胞中，dicentrine在1、2、4 μg/mL浓度下分别降低感染率11.27%、23.98%和26.29%，无鞭毛体减少74.24%、81.10%和83.92%。对巴西利什曼原虫，感染率降低22.33%、43.48%和62.23%，无鞭毛体减少56.59%、58.74%和64.71%。对婴儿利什曼原虫，感染率降低20.38%、28.39%和60.85%，无鞭毛体减少56.12%、64.42%和65.95%。在4 μg/mL浓度下，效果与1 μg/mL的AmpB相当或更优。
**2.4 Dicentrine诱导线粒体功能障碍和氧化应激**：在婴儿利什曼原虫前鞭毛体中，dicentrine在1.64和3.28 μg/mL浓度下显著降低ΔΨm，红/绿荧光比值从对照的32.56分别降至23.10和31.31（阳性对照FCCP为21.90）。同时，ROS水平分别增加183.88%和212.46%（阳性对照H2O2增加562.62%）。PI摄取实验显示膜完整性未受影响，表明细胞死亡并非通过坏死途径。
**讨论与结论**
讨论部分指出，dicentrine此前已显示对某些利什曼原虫的活性，但本研究首次从O. langsdorffii中分离并系统评估其对抗内脏和皮肤利什曼病原虫的活性。其高选择性和低毒性优于现有药物AmpB。机制上，dicentrine通过破坏线粒体膜电位和诱导ROS积累触发凋亡样死亡，而非坏死，这一特征有利于减少组织损伤。利什曼原虫拥有独特的单一巨大线粒体，对电子传递链干扰极为敏感，因此线粒体是有效的药物靶点。目前治疗药物如锑剂和AmpB毒性强且成本高，而dicentrine在体外表现出与AmpB相当的活性且毒性更低，有望成为更安全、经济的替代候选药物。结论部分总结：本研究首次从O. langsdorffii枝条中分离出阿朴啡生物碱dicentrine，并评估了其对三种利什曼原虫的活性。虽然部分抗利什曼效应此前已有报道，但本研究首次证明dicentrine可诱导寄生虫前鞭毛体线粒体破坏并促进ROS积累。综合体外结果，dicentrine对受试物种表现出选择性抗利什曼活性和对鼠巨噬细胞的低毒性。然而，这些数据仍属初步结果，未来需要进行体内研究，包括药代动力学评估和全面的临床前毒性验证，以确认该阿朴啡生物碱的治疗潜力和安全性。
