《Renewable Energy》：Bacillus licheniformis T13: A Bifunctional Strain for Sequential Lignin Depolymerization and Biohydrogen Production from Agro-Wastes
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摘要Bacillus licheniformis T13是从厌氧消化池污泥中分离得到的菌株，它具有在有氧条件下分解木质素以及在无氧条件下产生生物氢（H2）的双重代谢能力。在有氧条件下培养7天后，该菌株可使木质素脱色72.1 ± 4%，同时使Azure B染色剂降解58.4 ± 3
摘要
Bacillus licheniformis T13是从厌氧消化池污泥中分离得到的菌株，它具有在有氧条件下分解木质素以及在无氧条件下产生生物氢（H2）的双重代谢能力。在有氧条件下培养7天后，该菌株可使木质素脱色72.1 ± 4%，同时使Azure B染色剂降解58.4 ± 3%，并且还能产生阿魏酸（2.456 mg/L）和香草醛（0.907 mg/L）。基因组分析显示，该菌株含有多铜氧化酶（mco、yfiH）、AA10裂解型多糖单加氧酶、AA3氧化还原酶以及与丙酮酸脱氢酶（pdhA）结合的[FeFe]氢化酶（hydA），这些基因都为其多样的代谢功能提供了支持。在厌氧批次发酵过程中，该菌株从纯底物和农业废弃物中可产生0.042–0.089摩尔H2/摩尔己糖当量的氢气，其体积产率（mL H2/g VS）分别为：木糖（228 ± 9）、葡萄糖（215 ± 9）、食物废弃物（213 ± 10）、CMC（125 ± 8）和淀粉（115 ± 8）。将食物废弃物与玉米秸秆一起发酵时，氢气产量比单独使用玉米秸秆时高出53%（107 ± 6 mL/g VS vs 70 ± 5 mL/g VS）。Gompertz模型分析表明，该菌株的最大产率可达3.6 mL/g VS·小时，滞后期小于9小时。虽然木质素分解和氢气生产发生在不同阶段，但T13作为一种强大的单菌株平台，可通过依次利用木质素并发酵未经处理的农业工业废弃物中的水解产物，实现一体化生物加工。
引言
木质纤维素生物质和食物废弃物是可用于可持续生物燃料生产的丰富但尚未得到充分利用的可再生资源。木质素在木质纤维素材料中所占比例可达30%，其难以分解的特性严重限制了酶和微生物对其中碳水化合物的利用[1]。全球每年产生的食物废弃物超过13亿吨，这些废弃物富含碳水化合物、蛋白质和残留的木质纤维素，但目前大多未能得到妥善处理[2]。传统的物理化学预处理方法能耗较高，且常常会产生抑制发酵的物质。通过黑暗发酵产生的生物氢是一种清洁的能源载体，在燃料电池中的应用效率很高，但其经济可行性取决于是否能够使用低成本、未经处理的废弃物以及高效的微生物催化剂[3]。
利用能够修饰木质素和分解多糖的微生物进行生物预处理，可实现一体化生物加工（CBP），即在同一反应器中同时进行降解和发酵过程，从而降低成本并简化工艺流程[4]。虽然真菌在木质素降解研究中占据主导地位，但细菌菌株在生长速度、遗传操作便利性以及适应恶劣环境的能力方面具有优势。Bacillus属的菌株，尤其是B. licheniformis，以其多样的酶系和较强的耐逆性而闻名[5]、[6]。
最近的一些研究报道了具有双重木质素分解和产氢能力的细菌菌株。例如，从厌氧消化池污泥中分离得到的Bacillus subtilis T7[7]，以及经过工程改造的Escherichia coli菌株，都显示出在木质素和食物废弃物协同利用方面的潜力[8]。基于这一新兴领域，本研究对从厌氧消化池污泥中分离得到的一种新型B. licheniformis菌株T13进行了研究，该菌株具有优异的天然水解活性，且在未经处理的废弃物上也能表现出良好的性能。与许多需要预先处理或控制pH值的先前研究不同，T13能够在简化的条件下，通过多铜氧化酶及辅助酶实现木质素的氧化修饰，同时高效地进行糖化反应和黑暗发酵。本研究介绍了B. licheniformis T13的分离、酶学特性分析、基因组分析以及发酵性能。我们证明了该菌株具备在有氧条件下分解木质素、在无氧条件下产生生物氢的能力，同时还能够在以食物废弃物和玉米秸秆为代表的实际农业废弃物上实现一体化功能。这些研究结果表明，T13有望成为一种用于低投入废弃物转化為能源的理想微生物载体。
章节节选
样品采集、化学品与培养基
分析级化学品来自Sigma-Aldrich公司（木质素、Azure B），其他化学品则从当地供应商处购买（木聚糖、CMC、淀粉、葡萄糖、脱脂牛奶）。所有培养基均用蒸馏水配制，除非另有说明，否则均在121°C下高压灭菌15–20分钟。厌氧消化池污泥样本取自山东技术大学的工业化厌氧反应器，采集后立即置于冰上运输并尽快进行处理。
T13的分离
将污泥匀浆后（100 mL置于0.9% NaCl溶液中），在80°C下热冲击处理3小时，以此富集目标菌株
Bacillus licheniformis T13的分离与鉴定
首先对厌氧消化池污泥进行80°C下3小时的热冲击富集处理，随后在添加了木质素的矿物盐培养基中进行系列传代培养，最终获得了多个分离株。在37°C下培养72小时后，T13菌株在含有木质素的MSM琼脂上形成了最大的透明圈（25 ± 2毫米），同时在Azure B培养板上也出现了明显的脱色区（见图1a、b）。革兰氏染色结果显示该菌为革兰氏阳性杆菌。其能形成孢子，这一特征与分离过程中所使用的热冲击选择步骤相一致。通过16S rRNA测序和全基因组分析
讨论
分离得到的Bacillus licheniformis T13兼具木质素修饰和生物氢产生的特性，这一罕见的特点使其成为依次进行木质素分解和氢气生产的理想候选菌株。虽然本研究没有进行直接的孢子染色或耐热性测试，但该菌株被鉴定为B. licheniformis——这种菌种通常能够形成耐热的芽孢——这一事实为它在热冲击后的存活提供了生物学依据
结论
Bacillus licheniformis T13具有独特的两功能特性，既能够分解木质素，又能直接从未经处理的农业工业废弃物中产生生物氢。在该菌株在有氧条件下培养时，木质素脱色率可达72.1%，这一结果还通过溴乙酸分析以及HPLC检测阿魏酸和香草醛等芳香族单体得到了进一步验证。基因组分析结果显示，该菌株含有多铜氧化酶以及辅助酶类（AA10、AA3）
CRediT作者贡献说明
Tawaf Ali Shah：论文撰写——初稿撰写、可视化处理、结果验证、方法设计、实验研究、资金获取、正式分析、概念构思。Zhihe Li：论文撰写——审阅与编辑、项目监督、项目管理工作。Andong Zhang：论文撰写——审阅与编辑、资源提供。Hani Ali：资源提供、资金获取
数据可用性
该菌株的基因组数据已提交至NCBI，将在论文发表后被公开[生物项目编号：PRJNA1335638，生物样本编号：SAMN52017259，提交编号：SUB15679052]，其他数据则保存在补充数据文件中。
人工智能工具的使用
作者承认在论文撰写过程中使用了人工智能工具来提升语言表达质量。
资金支持
本研究得到了沙特阿拉伯吉达的阿卜杜拉齐兹国王大学所属的科学研究院（DSR）的资助，资助编号为IPP: 561-130-2025。作者在此对DSR在技术和资金方面的支持表示衷心的感谢。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
本项目得到了沙特阿拉伯吉达的阿卜杜拉齐兹国王大学所属的科学研究院（Deanship of Scientific Research）的资助，资助编号为IPP: 561-130-2025。作者对此表示感谢。此外，作者还对中国国家自然科学基金委员会（NSFC）提供的研究支持和经费援助表示衷心的感激（资助编号：T2350410498）。
Tawaf Ali Shah|Zhihe Li|Andong Zhang|Hani Mohammed Ali
中国山东省淄博市山东技术大学农业工程与食品科学学院，邮编255000
