在REACH框架下克服艰难、不可能及无意义的动物实验：运用非动物实验方法进行有效化学风险评估的机遇

《Regulatory Toxicology and Pharmacology》：Overcoming Difficult, Impossible, and Meaningless Animal Testing under REACH: Opportunities for Robust Chemical Risk Assessment with Non-Animal Approaches

　　•欧盟REACH法规的附件十一为推动非动物实验提供了框架。然而，在某些情况下，即便这些实验可能仅具有有限的（甚至没有）监管或科学价值，仍需进行新的体内（脊椎动物）研究以满足信息要求。在本文中，我们制定了具体的科学和程序标准，用以判断何时动物实验是困难的、不可能的或毫无意义的，并探讨如何通过非动物方法有效解决此类问题。我们明确了客观的判断标准，并将其应用于筛选REACH注册文件中可能存在此类情况的案例。•基于这些案例，我们建议：一）进一步完善相关判断标准及考量因素，使其适用于其他REACH评估指标，同时优先考虑人类健康；二）评估如何调整方法以避免在涉及人类健康指标时进行动物实验；三）在下一代风险评估框架下更具体地探讨基于暴露量的评估方法的应用（这种评估方法被广泛使用）。引言欧盟的化学物质注册、评估、许可和限制法规（REACH法规，EC编号1907/2006）旨在规范化学物质的生产、使用及其影响。该法规旨在在保障人类健康和环境安全的同时，维持并提升竞争力与创新能力。其中，核心理念便是推动采用非动物实验方法来评估化学物质的安全性，这一理念体现在一项基本要求上：如法规目标中所明确指出的，动物实验应仅作为最后手段使用。这一要求为采用现代非动物实验方法提供了监管依据，例如类推法、定量结构-活性关系分析、单独或结合使用的细胞实验等方法（如OECD 2017年提出的特定方法）。根据欧洲化学品管理局的数据，有30.9%的REACH注册案例拥有满足评估要求的实验数据（体内和体外实验）（ECHA，2023年）。另有32.7%的案例提交了替代方案，即那些经REACH允许用于替代传统实验方法的实验或非实验方法。在这些替代方案中，类推法最为常见，占比22.8%，该方法利用一种或几种物质的数据来预测结构相似或作用机制类似的另一种物质的特性。其他替代方案还包括基于科学依据省略数据的情况，占比7.1%；结合多种信息来源的权重分析方法，占比4.1%；以及定量结构-活性关系分析，占比2.8%。在REACH注册文件中定量结构-活性关系分析应用较少，这可能是因为在REACH实施初期，人们不确定监管机构是否接受这类分析结果，而且在2013年之前，符合监管要求的模型尤其针对人类健康指标的模型十分有限。尽管类推法被更广泛地使用，但由于注册方无法向欧洲化学品管理局证明所注册物质的相应特性可以通过类似物质的数据来预测，比如因为缺乏相关的桥接研究，这类方法常常被监管机构拒绝（Roe等人，2025a、2025b；Schmitt等人，2025年）。为应对这些挑战，一些重要的工具被开发出来，以增强监管机构的信任度并促进非动物实验方法的认可，其中最著名的包括欧洲化学品管理局的类推法评估框架（ECHA，2015年）以及OECD的定量结构-活性关系分析评估框架（OECD，2023年、2024年）。值得注意的是，这两个框架都是由监管机构为开展监管评估而制定的，这表明只要非动物实验方法具有科学依据且文档完备，监管机构不仅会允许其使用，还会主动引导对其的评估。这些框架代表了在科学界和监管层面推广非实验方法方面的重大进展。然而在实践中，关于如何解读和接受这些方法仍存在不确定性，监管信任度、法律确定性以及相关指导的连贯性，依然是阻碍REACH框架下广泛且可靠地应用非动物实验方法的主要障碍。实际上，尽管REACH法规中有明确的法律依据，尤其是第13条第1款规定可在符合附件十一要求的情况下使用非实验方法，第25条第1款要求脊椎动物实验仅作为最后手段，但实际执行过程中，监管期望与向非动物实验方法转变的目标之间仍存在持续的不匹配。2010年至2018年间提交的注册文件中，由于在指导文件制定过程中可能存在解释上的不确定性，导致程序上较为僵化，进而使得注册方和监管机构对监管风险的认知存在差异。政策目标与程序僵化之间的矛盾构成了核心挑战（Stoykova等人，2025年）。一个致力于推动向基于科学的非动物安全评估方法过渡的全球性多学科组织——无动物安全评估合作组织最近的分析表明，现有框架不足以确保完全符合“最后手段”要求（Macmillan等人，2024年）。尽管法律要求尽量减少动物实验，但在许多情况下，传统的脊椎动物实验仍在继续进行，这并非因为这些实验在科学上合理，而是出于监管便利的考虑，即为了避免因试图遵循附件十一要求而导致的监管延误或审批被拒。这种情况似乎更多是由程序上的障碍以及更广泛的制度性壁垒共同造成的，而非单纯的解释问题。已有的案例包括僵化的行政流程、不接受现有的非动物数据或类推法提案，以及可能鼓励采用传统实验方法的限制性实施措施。虽然不同评估指标和注册文件中问题的表现形式可能有所不同，但这些障碍在各种监管环境中的反复出现表明，这一问题具有系统性，而非个例。这种情况可能会阻碍创新和效率的提升，而这些正是将非动物实验方法有效纳入REACH安全风险评估、进而更好地保护人类健康和环境所必需的（Stoykova等人，2025年；Oldenburger等人，2022年；van den Heuvel等人，2023年）。鉴于这些挑战以及建立更为连贯的监管框架的必要性，欧盟委员会对“2021年欧盟公民倡议：安全无残忍化妆品”（委员会注册编号：ECI(2021)000006）作出了回应。在回应中，欧盟委员会承认需要通过综合策略来解决这一明显的不匹配问题，最终促成了逐步淘汰动物实验的路线图的制定与实施。自REACH法规出台近20年来，欧盟委员会一直在努力推动该法规的修订，旨在提升行业竞争力、减轻行政负担，进一步加强对人类健康和环境安全的保障，同时为采用更为现代化、简化且无需使用动物的化学物质安全评估方法铺平道路。为实现这些目标，对法规进行修订是一个重要机会，它有助于落实动物实验作为最后手段的要求，充分发挥REACH在采用更先进的环境和健康风险评估方法方面的潜力。无动物安全评估合作组织启动了当前项目，旨在为这一讨论做出贡献，通过制定具体的科学和程序标准，明确何时动物实验是困难的、不可能的或毫无意义的，以及如何通过非动物方法有效解决此类问题。通过明确指出在哪些情况下动物实验不仅没有必要，而且在科学上也不具备合理性，这一举措旨在使REACH的法律法规与其实际执行相一致，确保监管决策是基于科学依据而非程序惯例。在现行的REACH法规中，对于附件七至附件十第一列所规定的标准信息要求，允许的偏差情况要么在相应附件的第二列中关于特定调整规则的描述中说明，要么在附件十一中说明，后者规定了在科学上有依据的情况下可替代动物实验的方法，或在特定条件下可免除某些测试，尤其是涉及脊椎动物的测试。然而，在某些情况下，附件十一中规定的调整措施的适用和接受程度还不够一致，难以完全实现REACH法规中“最后手段”的要求。最新分析显示，类推法在测试方案评估和合规性检查中都被使用，但其是否被接受在很大程度上取决于相关依据的充分性（Roe等人，2025a年）。因此，相关的决定草案似乎倾向于让人们默认依赖标准信息要求，从而限制了注册方充分利用附件十一规定来减少或消除不必要的动物实验。目前，附件十一规定了三种可调整或免除测试的情形：1.该测试在科学上毫无必要；2.该测试在技术上无法实现；3.针对特定物质并基于暴露量进行的调整已经足够。上述分类在概念上是合理的，但由于下文所述的监管和解释方面的挑战，实际上并未得到充分运用：科学上的冗余性与无关性：基于科学依据避免动物实验的措施包括利用现有数据、采用权重分析方法以及使用适当的非动物实验方法（如类推法、体外实验或计算机模拟实验）。然而，当动物实验不仅没有必要（即有其他非动物实验方法或途径足够），而且在科学上与健康和环境安全评估的背景无关或无法提供有用信息（即“毫无意义”）时，就会出现问题。例如，对于那些由于其固有特性——如水溶性极差、挥发性高或极易发生生物降解/暴露水平极低——而在水中不会存在或无法发挥生物活性的物质，进行水生毒性测试可能并无意义。此外，如果某种物质不会对人类造成显著暴露，那么根据下一代风险评估原则，应当足以免除使用哺乳动物作为模型来获取毒理学效应信息的测试（Dawick等人，2025年；ECETOC，2020年）。从科学角度来看，某些动物模型对于特定的关注机制可能具有有限的生理相关性，这一方面在现行的REACH框架中并未明确提及，但在现代毒理学研究中越来越受到重视（Kaplan等人，2024年）。因此，明确这些相关性的程度至关重要。另外还需要注意的是，历史上的体内实验方法的适用范围和局限性，相比现代方法，较少受到质疑或得到正式阐述（Browne P.等人，2019年）。由于缺乏对这些局限性的明确记录，人们可能会误以为这些方法具有广泛的适用性，因而十分可靠。相比之下，现代非动物实验方法通常都有明确规定的使用条件和验证范围。这种差异可能会无意中造成对动物实验的偏好，从而削弱安全评估的科学性，并影响“最后手段”要求的落实（Fentem等人，2021年）。这一点在一些欧洲化学品管理局上诉委员会的判决中也有体现（例如A-003-2014号案件，Symrise AG公司；A-011-2018号案件，Evonik Operations GmbH公司），在这些案件中，基于附件十一的非动物实验方法在文件评估阶段最初并未被接受，这凸显了注册方在寻求监管机构认可此类调整方法时可能面临的实际困难。技术上的不可行性与测试难度大的问题：附件十一已经允许在动物实验在技术上不可行时免除相关测试。然而，相关的指导文件（欧洲化学品管理局，2008年、2016年、2025年），尤其是与第13条第3款相关的部分，往往表述模糊，未能充分阐述传统体内实验方法的局限性。现行法律文本主要关注的是由于物质的物理化学性质或方法学限制而导致动物实验在技术上不可行的情况，而对体内实验方法本身的科学和生物学局限性则考虑得相对较少。这些局限性可能包括适用范围受限、物种特异性生物学特征、某些评估指标的人类相关性较低、数据变异性大、重复性较差，或是研究设计中使用的剂量水平过高，从而导致生物学合理性降低。如果能在所有测试方法中更加重视并详细记录这些局限性，就能在依据附件十一进行证据评估时做到更加客观和透明，避免因指导文件或报告框架中对某些方法的局限性描述不够清晰而产生不必要的偏见。在某些情况下，虽然测试并非完全不可行，但被认为难度较大，此时人们常常会要求对标准流程进行修改，却未必了解这些修改会对测试的可靠性、有效性和相关性产生何种影响。迄今为止，只有OECD的一份文件，即关于水生毒性测试中难以处理的物质和混合物的OECD指导文件23（OECD，2019年），提供了在某些情况下如何处理难以测试的物质的指导，而且仅限于水生毒性测试领域。根据该指导文件中的具体测试调整方案，测试结果的有效性可能会受到影响，从而无法用于监管目的。这主要是因为测试报告中的科学细节和相关的测试调整信息可能难以融入更为规范的监管文件中（例如在稳健研究总结中）。因此，这些并不一定符合监管要求的调整方案很容易被忽视。迄今为止，经合组织尚未制定针对难以检测的物质在人类健康终点方面的相应指导原则，这可能在一定程度上解释了为何在哺乳动物毒性研究中很少使用附件十一中的技术豁免条款。综合上述种种因素，注册人可能会因为担心因资料中存在数据缺口而导致申请被拒，而决定不对难以检测的物质提出任何调整方案。在这种情况下，经过验证的非动物实验方法，如机制性定量结构-活性关系分析、类推法以及其他计算模型或体外模型，不应仅仅被视为替代方案，而应作为满足终点要求的首选科学工具，这与REACH中关于动物实验的“最后手段”要求是一致的。除了履行这一法律和伦理要求外，这些方法往往还能提供更具机制相关性和与人类相关的预测结果，尤其是在直接测量（如体内实验）在技术上不可靠、不可行或解释价值有限的情况下。因此，使用非动物实验方法有助于做出能够为人类健康提供至少同等保护水平的监管决策，在某些情况下甚至能实现更高水平的保护。例如，对于一些难以检测的物质，现有的功能性计算机模拟方法，如某些定量结构-活性关系分析，可用于预测慢性鱼类毒性。如果这些方法的预测结果明显在允许范围内，并且能够证明其预测的可靠性，那么就应优先考虑使用这些方法而非进行动物实验（Nyman等人，2025年；Thomas等人，2019年、2025年；Kienzler等人，2016年；Schmidt等人，2021年；Pore等人，2025年）。水生毒性测试领域普遍存在这类问题，经合组织也一直在多年间逐步制定和更新相关指导原则。然而，在其他领域，类似的指导原则尚不完善（CEFIC7）。在这种情况下，应鼓励注册人充分且基于科学依据地运用附件十一中规定的经过验证的非动物实验方法（House等人，2021年）。当对于那些极难检测的物质（如溶解度很低的物质）必须进行动物实验时，往往会产生适得其反且具有误导性的结果：根据作者的经验，通常需要重复实验才能获得可靠且高质量的数据，这不仅增加了使用的动物数量，而且得到的结果仍可能无法完全满足信息需求。这种做法不仅违背了“最后手段”的要求，还会产生具有争议的监管价值的数据。同时，对于某些难以检测的化学物质类别，可能会出现一种“恶性循环”：由于缺乏关于慢性终点的可靠数据，就无法开发或验证可靠的定量结构-活性关系分析及其他预测模型，而这又进一步导致人们继续依赖新的动物实验，却未能从根本上解决这些实验为何不可靠且无关紧要的问题。要打破这一循环，就需要有针对性地努力加强人们对由于测试物质特性而导致的标准测试局限性的科学认知和监管理解，同时接受非动物实验方法，既要改善基础数据基础设施，也要确保优先使用那些经过验证的计算机模拟和体外工具，因为它们才是基于科学依据的首选方案。

附件十一与附件七至十之间的协调问题：在安全性信息要求方面，附件十一的规定与附件七至十的要求在一致性及层级关系上存在模糊之处，这一直是个难题。附件七至十的严格结构往往会使附件十一中更为灵活的规定被忽视。这一因素很可能使注册人不敢提交那些基于科学依据、更符合物质特性以及“最后手段”要求的定制化方案，因为这类非动物实验方法可能被认为不足以填补数据缺口，从而导致申报资料不符合要求。此外，要证明通过替代方法（调整方案）获得的数据符合安全性信息要求所规定的标准往往也很困难。大多数安全性信息要求都是针对特定方法制定的，要求提供来自特定体内实验的结果和终点数据。因此，非动物实验或综合方法得到的数据可能与其传统研究得到的数据并不完全相同。不过，它们仍能为危害和风险评估提供具有同等或更高科学相关性和预测价值的资料。出现这种脱节现象的原因是，尽管附件十一和第13条第3款为使用基于科学依据的非动物实验方法提供了灵活性，但REACH的信息要求仍然常常从特定体内实验或终点的角度来解读，从而限制了替代证据的实际应用。（ICCVAM，2024年；Levine等人，2024年；Stucki等人，2022年）

对于计算机模拟方法的使用，情况则略有不同。这类方法是为特定的终点设计的，用于提供定量（或定性）预测，因此有时可以直接在监管背景下替代体内实验，或者在与文献中的可靠信息相结合时，纳入风险权重评估方法之中。

DIM项目的目的与方法
为应对上述挑战，尤其是附件十一规定未能得到充分运用的问题，以及进一步推动非动物实验方法的更多应用，AFSA合作组织启动了一个多阶段项目。该项目的目标是探讨在REACH框架下哪些动物实验行为可被视为DIM，进而为监管改革以及加速采用非动物实验方法提出有针对性的建议。

DIM标准的制定与数据挖掘策略
数据挖掘分析旨在作为一种概念验证，以评估是否可以利用客观的物理化学标准来识别REACH申报资料中可能存在DIM测试的场景，同时初步判断可以避免的脊椎动物实验的频率。这份搜索标准清单经过了专家团队的审核，随后被用于对公开可获取的REACH注册申报资料进行数据挖掘，具体内容见表2。所分析的数据集包括……

案例研究讨论：实践中DIM的真实案例及建议
在数据挖掘分析的同时，利用已识别的DIM场景选取并分析了若干具有代表性的案例，探讨在REACH框架下如何应用各种调整方案和替代方法，以及监管机构是如何评估和接受这些方法的，同时找出阻碍其在实践中更广泛应用的常见局限及机遇。2025年4月至9月期间，项目成员们分享了多个案例研究，这些案例研究随后得到了展示和讨论。

结论与后续步骤
REACH法规已经体现了科学相关性、灵活性以及尽量减少动物实验的核心原则。然而，在实际执行过程中，非动物实验方法的整合程度尚未达到预期水平。DIM项目表明，通过识别那些动物实验“困难、不可能或毫无意义”的场景，可以为始终如一地落实“最后手段”要求提供一条有条理、基于证据的路径。通过将决策建立在……之上

CRediT作者贡献声明
Steve Gutsell：写作——审稿与编辑、验证、方法学。Jean Knight：验证、调查、正式分析、数据整理。Aleksandra Mostrag-Szlichtyng：写作——审稿与编辑、验证、方法学。Martijn van Velthoven：写作——审稿与编辑、初稿撰写、验证、项目管理、方法学、数据整理、概念构建。Kyle Roush：写作——审稿与编辑、验证、方法学。Giorgia Pallocca：写作——审稿与编辑。

未引用参考文献
ECHA，2016a；Knight等人，2023年；Pradeep等人；欧洲化学品管理局，2023年；Pallocca等人；经合组织，2017年。

利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文所述工作的已知财务利益或个人关系。
Martijn van Velthoven | Giorgia Pallocca | Vicente Aranda | Anders Bergqvist | Maria Blanco-Rubio | Kevin Bonnot | Jay Dawick | Mojca Fuart-Gatnik | Marlly Guarin | Steve Gutsell | Jean Knight | Aleksandra Mostrag-Szlichtyng | Kyle Roush | Marten Schults | Eva Serrano-Candelas | Sagar Thakali | Paul Thomas | Xiaoling Zhang | Jay Ingram