日本结直肠癌中colibactin相关突变过程的流行率与时间序列及其微生物组谱

《Nature Genetics》：Prevalence and chronology of colibactin-associated mutational processes and their microbiome spectra in Japanese colorectal cancer

　　

近几十年结直肠癌（CRC）发病率呈上升趋势，日本及多国年轻人群增幅尤为显著。尽管肠道微生物群对CRC发病机制的病因学贡献已被认可，但其具体机制尚未完全阐明。研究人员整合了CRC的全基因组测序（WGS）与转录组分析，以及粪便样本的全基因组宏基因组测序（WGMS），以高分辨率解析宿主-微生物组互作。可解释人工智能的应用将CRC划分为四种不同的微生物组知情亚型。WGS分析鉴定出与colibactin暴露相关的突变特征SBS88和ID18，作为早期克隆事件在非超突变患者的44.8%中被检出，且这些特征在1960年代后出生患者中显著更频繁。基于微生物组的再分类揭示了亚型特异的临床与分子特征。综上，研究结果表明colibactin暴露构成日本人群中CRC一种普遍且潜在可修饰的危险因素。

研究背景与立项依据

全球结直肠癌（CRC）发病率持续上升，日本早发性结直肠癌（诊断年龄<50岁）自1990年代以来增长尤为突出，且日本发病率高于西方，提示存在地域特异性因素。肠道微生物群已被确认为CRC发病机制的关键决定因素，其中携带pks基因岛、产colibactin的 Escherichia coli 等肠道菌产生的基因毒素colibactin可诱发DNA链间交联与双链断裂，并在肿瘤基因组中留下特征性突变印记——单碱基替换特征SBS88与短插入缺失特征ID18。前期多大陆千人级WGS研究发现日本SBS88/ID18流行率最高，但日本本土大样本整合宿主基因组与粪便宏基因组的系统分析尚缺。为此，研究人员开展本研究，成果发表于《Nature Genetics》，旨在明确colibactin相关突变过程在日本CRC中的流行率、时间序列及对应微生物组谱。

主要技术方法与队列

研究人员合并新建立cohort 1（255例治疗 na?ve 组织学确诊CRC，其中200例做WGS、196例做WGMS）与既往cohort 2（146例健康对照HC及部分CRC宏基因组数据），总计600参与者（454 CRC+146 HC）。对CRC肿瘤与配对淋巴细胞DNA行WGS（~56×），对粪便行全基因组宏基因组测序（WGMS）。构建随机森林分类器（基于4个独立公开队列训练，MetaPhlAn3物种相对丰度输入）判别CRC相关微生物特征，再用SHAP（Shapley Additive Explanations）可解释人工智能框架对SHAP值作k-means聚类，划分4个微生物亚型。突变特征分解采用SBS/ID签名重构（整合Mutographs 953例共1153例非超突变/超突变分层），并以trinucleotide上下文概率法将驱动基因突变归因colibactin签名；进化时序分析采用早期/晚期克隆与亚克隆分层法；免疫微环境用CIBERSORTx反卷积RNA-seq，FOXP3免疫组化验证；clbP基因拷贝数用qPCR与WGMS交叉验证。

研究结果

Participants and methods of analysis：cohort 1入组255例经结肠镜/手术确诊非遗传性CRC，200例获WGS、196例获WGMS；HC为结肠镜阴性者146例源自cohort 2。CRC组Brinkman Index与年龄显著高于HC。

Construction of a gut microbiome-based CRC classifier：随机森林在外部验证AUC 0.84，cohort 2 AUC 0.68，合并cohort 1+2的395 CRC vs 146 HC得AUC 0.71~0.74，证明模型可重复。

Identification of CRC subtypes based on gut microbiota composition：SHAP识别Peptostreptococcus stomatis、Fusobacterium nucleatum、Parvimonas micra、Dialister pneumosintes为主要判别菌种；k-means得出4亚型，subtype 2具最高CRC微生物特征分（F. nucleatum与P. stomatis驱动），subtype 1最低且无主导菌种。两独立队列均复现4亚型。Kaplan–Meier显示4亚型总生存（log-rank P=0.040）与无进展生存（P=0.0070）差异显著，但Cox多变量校正分期后亚型无独立预后效应，分期是混杂因素。

Differentiation of clinical characteristics and genomic abnormalities by microbiome-based subtypes：subtype 3患者年龄显著低于其余亚型（P<0.016），1980年后出生者subtype 3比例明显上升（P=0.018）；subtype 2分期偏晚且超突变比例高于subtype 3（P=0.014）；RNA-seq示subtype 2非人细菌读数最多。

Analysis of mutational signatures and their correlation with the gut microbiome：183例非超突变CRC中82例（44.8%）检出SBS88和/或ID18≥5%贡献，且与colibactin特异SBS基序（突变位点?3、?4位双A）和ID基序（胸腺嘧啶均聚区单T缺失上游1~4位A）显著正相关。SBS88/ID18在<40岁、左半/直肠、II期以上显著富集；1965年后出生者贡献攀升（ID18 P=0.0035，SBS88 P=0.014）。subtype 3较subtype 1签名贡献更高（ID18 P=0.014）。驱动基因归因示15.3%非超突变CRC带colibactin式APC/BRAF D594G/TP53突变，APC intron 8剪接位点热点（AAT>AGT）8/183例，伴SBS88显著升高（P=0.0082）；ID18式APC移码缺失（TTTT>TTT）14例。粪便clbP检出率11.9%，但与签名贡献无相关；肿瘤组织clbP全阳性但与签名亦无直接量化相关。

Timing of colibactin signatures and their association with early-onset CRC：SBS88偏好早期克隆突变（早于晚期克隆/亚克隆），高早期克隆SBS88负担30例年龄显著更低（P=1.1×10??），与<10岁起突变既往报道一致；subtype 3的CNN-LOH/ loss+gain事件早于subtype 2（P=0.018）。个案CM099（54岁女性II期左半）APC剪接热点归早期克隆，推断首十年内发生。

Immune environment in colibactin-associated CRC：CIBERSORTx示subtype 3浆细胞、静息肥大细胞多于subtype 1/2，静息NK细胞少于subtype 2；仅subtype 3内T_reg比例与SBS88/ID18正相关（FOXP3+IHC密度与CIBERSORTx T_reg估计值R=0.73/0.55）。TMB^highGEP^high（免疫热）在subtype 3少于subtype 1/2（P=0.0040），高SBS88计数者TMB^highGEP^low比例更高，提示colibactin高负荷亚型偏免疫冷。

讨论与结论翻译

本研究首次将粪便宏基因组与CRC组织WGS整合，划出4微生物亚型：subtype 3粪便F. nucleatum低却年轻化且colibactin签名高；subtype 2具F. nucleatum/P. stomatis高丰度且分期晚。colibactin相关签名见于约45%日本非超突变CRC，1965年后出生者骤增，并新确认BRAF D594G带colibactin印记。SBS88/ID18共现且<40岁富集，区别于SBS93/ID14（<60岁富集）。日本高负担可用生命早期pks? E. coli定植与1970年代末起广泛抗生素使用解释，subtype 3约1985后上升较SBS88迟约20年。subtype 3的T_reg浸润符合colibactin致衰老相关炎症促T_reg分化假说，但因果需空间免疫学验证。单次clbP丰度不反映历史累积突变负担。结论：colibactin暴露是日本CRC中普遍、早发、潜在可干预的危险因素；微生物组亚型揭示异质致癌通路，为早筛与微生态干预提供靶点。