SARS-CoV-2刺突蛋白肽段通过脊髓TLR4通路触发伤害性感受反应

《European Journal of Pain》：SARS-CoV-2 Spike Peptides Trigger Nociceptive Responses Through Spinal TLR4 Pathways

　　

摘要

背景：疼痛是COVID-19常见的神经系统表现，但SARS-CoV-2刺突蛋白片段参与伤害性感受加工的机制仍知之甚少。研究人员研究了刺突蛋白衍生肽是否直接激活参与疼痛信号传导的脊髓神经免疫通路。

方法：雄性C57BL/6小鼠接受三种合成SARS-CoV-2刺突蛋白衍生肽（PSPD2001、PSPD2002或PSPD2003）或生理盐水的鞘内给药。使用von Frey试验评估机械性伤害性感受。通过药理学拮抗剂、TLR4基因敲除小鼠、RT-qPCR、ELISA、免疫荧光、CX3CR1^GFP/+小鼠、人C20小胶质细胞和分子动力学模拟，研究了脊髓Toll样受体4（TLR4）、小胶质细胞及p38 MAPK/NF-κB信号通路的参与情况。

结果：所有刺突蛋白衍生肽均诱导机械性伤害性感受，其中PSPD2003产生的反应最为显著。PSPD2003增加了脊髓TLR4表达，升高了TNF-α和IL-6水平，并促进了背角小胶质细胞的激活，表现为TMEM119和CX3CR1阳性细胞增加。这些伤害性感受和神经炎症效应被TLR4、小胶质细胞、p38 MAPK和NF-κB信号通路的药理学抑制以及TLR4^?/?小鼠所消除，证明TLR4信号传导对PSPD2003诱导的疼痛至关重要。PSPD2003还在人小胶质细胞中诱导了肥大表型，而分子动力学模拟支持其与TLR4/MD-2复合物的稳定相互作用。

结论：这些发现揭示了一种此前未被识别的神经免疫机制，即SARS-CoV-2刺突蛋白衍生肽通过TLR4依赖性小胶质细胞激活及下游p38 MAPK/NF-κB信号传导触发脊髓伤害性感受，强调脊髓TLR4–小胶质细胞轴作为COVID-19相关及病毒后疼痛潜在治疗靶点的重要性。

意义声明：本研究首次提供证据表明SARS-CoV-2刺突蛋白衍生肽直接激活脊髓TLR4依赖性神经免疫通路以诱导伤害性感受。通过整合行为学、药理学、遗传学、细胞和计算方法，研究确定小胶质细胞激活及p38 MAPK/NF-κB信号传导是将病毒肽与疼痛联系起来的关键机制，为COVID-19及病毒后疼痛提供了机制框架，并支持TLR4作为潜在治疗靶点。

**论文解读：SARS-CoV-2刺突蛋白肽段经脊髓TLR4通路触发伤害性感受的机制研究**

**一、研究背景与科学问题**

自2019年12月以来，COVID-19大流行已影响全球数亿人。国际病毒分类委员会将病原体命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2），其与蝙蝠来源的SARS相关冠状病毒约有88%的序列一致性。临床上，COVID-19常见表现包括发热、咳嗽、肌痛和流涕，重症可进展为头痛、呼吸困难、病毒性肺炎和呼吸衰竭。值得注意的是，疼痛——尤其是肌痛和关节痛——是COVID-19患者中频繁报告的症状，也是早期功能损害的主要因素。患者中肌痛患病率在不同研究中差异显著（3.36%至超过64%），汇总估计患病率约为19.3%。临床证据还表明，即使非住院患者在感染后数周也可能出现已有神经病理性症状的恶化，表明疼痛加重不局限于重症形式。

SARS-CoV-2是一种包膜单链RNA病毒，其基因组编码刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）等结构蛋白。刺突蛋白高度糖基化，通过高亲和力结合血管紧张素转换酶2（ACE2）受体介导病毒附着和进入。Toll样受体，特别是Toll样受体4（TLR4），已成为SARS-CoV-2诱导炎症的重要介质。TLR4是先天免疫的关键组成部分，识别感染和组织损伤期间释放的损伤相关分子模式并放大炎症反应。鉴于TLR4在脓毒症和肺炎中的既定作用，研究人员推测TLR4可能也参与COVID-19相关疼痛。基于这一前提，本研究通过鞘内给药三种合成刺突蛋白衍生肽，系统探究了脊髓TLR4在SARS-CoV-2刺突蛋白片段诱导的小鼠伤害性感受中的作用。

**二、主要关键技术方法**

本研究整合了多维度的研究手段。动物实验使用238只雄性C57BL/6野生型、TLR4基因敲除（TLR4^?/?）和CX3CR1^GFP/+小鼠（8周龄），来源于机构动物设施并经巴西合作者提供。采用Fmoc固相肽合成策略制备三种刺突蛋白S1亚基衍生肽PSPD2001（RVYSSANNC，残基158–166）、PSPD2002（VNLTTRT，残基16–22）和PSPD2003（NNATN，残基121–125），纯度≥95%。行为学方面采用von Frey细丝法测定机械性缩足阈值。分子层面运用RT-qPCR评估TLR4 mRNA表达、ELISA定量TNF-α和IL-6水平、免疫荧光检测TMEM119和CX3CR1标记的小胶质细胞。使用TLR4拮抗剂LPS-RS、小胶质细胞抑制剂米诺环素、p38 MAPK抑制剂SML0543和NF-κB抑制剂PDTC进行药理学干预。此外，采用AMBER24软件包进行100 ns分子动力学（MD）模拟，评估PSPD2003与TLR4/MD-2复合物的结合稳定性，并通过MM/GBSA方法计算结合自由能。体外实验使用人C20小胶质细胞系验证TLR4依赖性激活。

**三、研究结果**

**3.1 SARS-CoV-2刺突蛋白衍生肽诱导的伤害性感受及脊髓TLR4参与**：三种肽（25 ng和50 ng剂量）在鞘内给药后1至7小时内均显著降低机械性伤害性阈值，24小时恢复至基线水平。TLR4拮抗剂LPS-RS预处理可有效逆转三种肽诱导的伤害性感受，且三种肽在TLR4^?/?小鼠中均不产生任何显著的伤害性阈值变化，充分证明TLR4是介导这些肽效应的必需因子。

**3.2 脊髓小胶质细胞参与肽诱导的伤害性感受**：小胶质细胞激活抑制剂米诺环素预处理显著减轻了三种肽诱导的疼痛行为，其中对PSPD2002和PSPD2003的抑制效应从1小时持续至7小时，表明小胶质细胞激活是该伤害性感受过程的关键环节。

**3.3 SARS-CoV-2肽调节脊髓促炎细胞因子水平**：鞘内给药后3小时，PSPD2002和PSPD2003显著增加脊髓IL-6水平，PSPD2003同时显著增加TNF-α水平，而PSPD2001对两种细胞因子均无显著影响，提示不同肽段可能差异化地激活炎症信号通路。

**3.4 PSPD2003增加脊髓TLR4 mRNA表达**：RT-qPCR分析显示，仅PSPD2003处理组在给药后3小时出现脊髓TLR4 mRNA表达的显著上调，而PSPD2001和PSPD2002未改变受体基因表达，表明PSPD2003是三者中与TLR4直接相互作用最强的肽段。

**3.5 p38 MAPK/NF-κB信号通路介导PSPD2003诱导的伤害性感受**：p38 MAPK抑制剂SML0543和NF-κB抑制剂PDTC预处理均能显著逆转PSPD2003诱导的疼痛行为（1至7小时），但对PSPD2001和PSPD2002诱导的伤害性感受无影响，揭示PSPD2003特异性依赖p38 MAPK/NF-κB下游信号。

**3.6 免疫荧光鉴定伤害性感受期间脊髓背角小胶质细胞**：PSPD2003给药后3小时显著增加野生型小鼠和CX3CR1^GFP/+小鼠脊髓背角中TMEM119阳性和CX3CR1阳性小胶质细胞数量，而在TLR4^?/?小鼠中该增加效应消失，证实PSPD2003诱导的小胶质细胞激活依赖于TLR4信号通路。

**3.7 PSPD2003与TLR4的稳定特异性结合**：分子动力学模拟显示，PSPD2003与TLR4形成稳定复合物，RMSD和RMSF分析确认受体结构收敛且未被破坏。MM/GBSA结合自由能分别为?22.1±5.6和?18.1±6.3 kcal/mol，属于高亲和力分子复合物范围。关键TLR4残基（L638、L654、R650、P681、Y691和F711）位于保守的600–700区域，贡献了主要结合能量。

**3.8 PSPD2003对人小胶质细胞的体外效应**：人C20小胶质细胞经PSPD2003刺激后呈现肥大形态表型（细胞体增大），与激活状态一致；LPS-RS预处理可基本阻止这些形态变化。虽然PSPD2003刺激未显著增加TNF-α释放，但TLR4阻断能阻止形态学改变，为PSPD2003直接通过TLR4机制作用于小胶质细胞提供了补充证据。

**四、讨论与结论**

本研究首次证明SARS-CoV-2刺突蛋白衍生肽可直接激活脊髓TLR4依赖性神经免疫通路以诱导伤害性感受。研究揭示的机制通路为：刺突蛋白肽段（特别是PSPD2003）→脊髓TLR4激活→小胶质细胞活化→p38 MAPK/NF-κB下游信号传导→促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）释放→中枢敏化→伤害性感受。这一TLR4–小胶质细胞–p38 MAPK/NF-κB–细胞因子信号轴为理解COVID-19相关疼痛提供了全新的分子框架。

值得注意的是，PSPD2001和PSPD2002虽也诱导TLR4依赖性疼痛行为，但未改变TLR4基因表达，也不依赖p38 MAPK/NF-κB通路，提示这两种肽可能通过间接机制或替代性TLR4相关信号级联发挥作用，反映了刺突蛋白不同结构域的功能特化。研究还发现刺突蛋白受体结合域可通过ACE2依赖性途径选择性促进IL-18、TNF-α和S100B释放，表明不同结构域可差异化激活免疫信号。

研究存在一定局限性：仅使用雄性小鼠（为减少生物学变异），体外实验未设LPS-RS单独对照组，以及C20细胞中PSPD2003未显著增加TNF-α（可能因分离培养无法完全模拟体内多细胞类型间的协同炎症网络）。尽管如此，这些发现仍具有重要的转化意义——脊髓TLR4–小胶质细胞轴被确定为COVID-19相关及病毒后疼痛的潜在治疗靶点，TLR4调节策略有望用于控制SARS-CoV-2感染相关的疼痛和高炎症反应。该研究发表于《European Journal of Pain》。

**研究结论**：本研究首次证明SARS-CoV-2刺突蛋白可通过TLR4信号传导激活脊髓小胶质细胞并释放促炎细胞因子，从而诱导伤害性感受。这些发现为病毒蛋白片段如何直接参与中枢神经系统内先天免疫通路并促进COVID-19相关疼痛表现提供了机制性见解。此外，研究结果将TLR4确定为有前景的治疗靶点，并强调TLR4调节策略在管理SARS-CoV-2触发的感染相关疼痛和高炎症反应中的潜力。