深度学习引导的crRNA设计可实现基于与逻辑门的自催化CRISPR网络，用于双重miRNA检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Deep Learning-Guided crRNA Design Enables an AND Logic-Gated Autocatalytic CRISPR Network for Dual-miRNA Detection

　　

摘要

基于CRISPR/Cas12a的miRNA检测通常受限于经验性的crRNA序列筛选、单链识别以及较低的转录切割灵敏度。为解决这些问题，我们开发了一种干湿结合的集成诊断平台，将数据驱动的crRNA预测与可编程核酸电路相结合。首先，我们构建了一个名为DiagCRISPR的深度学习模型，该模型采用局部连接神经网络架构，通过训练公共的双链DNA动力学数据集，来捕捉序列活性与位置之间的关联。为了将这一针对双链DNA训练的模型应用于无PAM序列的短单链DNA诊断底物，我们设计了虚拟PAM平均算法，从而建立了适用于非典型单链DNA靶标的通用crRNA设计平台。其次，我们设计了一种基于上游引物交换反应的AND逻辑门，能够将miR-21和miR-155的同时存在转化为单一触发链。这一分子触发剂随后会启动由分裂型crRNA介导的自催化CRISPR扩增网络，通过反复循环利用Cas12a实现指数级的信号传递。该集成检测方法对miR-21的检测下限可达785飞摩尔，对miR-155的检测下限为778飞摩尔，整个分析时间不到2小时，且在复杂的血清样本中仍能保持高度的特异性和可靠的检测效果。这种工作流程结合了计算预筛选与生化电路设计，大幅降低了实验中的试错成本，同时保持了多指标诊断的分析灵敏度和逻辑准确性。因此，这一干湿协同平台为多标志物临床筛查及个性化液体活检提供了高效可靠的方法。

引言

微小RNA是一类长度较短的内源非编码RNA（19-25个核苷酸），它们通过与互补的信使RNA结合，发挥关键的转录后基因表达调控作用[1]、[2]。异常的miRNA表达谱与肿瘤的发生、发展、临床分期以及治疗预后密切相关，且在不同类型的恶性肿瘤中表现出不同的模式[3]、[4]。重要的是，miRNA失调往往涉及同一癌症类型中多种miRNA的异常表达，同时某些miRNA在多种癌症中都会出现上调现象[5]、[6]。因此，仅依靠单一miRNA的生物信息往往不足以准确反映疾病早期的复杂性，从而导致筛查中出现较高的假阳性和假阴性率。因此，开发能够同时分析多种miRNA的生物传感器策略，对于提升无创液体活检的全面性、准确性及临床可靠性至关重要。

由于具有极高的序列特异性以及在等温条件下的目标激活转录切割活性，成簇规律间隔短回文重复序列/Cas12a系统得到了广泛应用[7]。当CRISPR RNA引导Cas12a识别到互补的DNA靶标时，Cas12a会发生构象变化，进而持续降解非特异性的单链DNA报告分子[8]。尽管具有这些显著优势，但基于CRISPR的miRNA检测在实际应用中仍面临三个相互关联的挑战。首先，crRNA序列的选择仍然主要依赖于基于总体GC含量和预测的二级结构等粗略参数的经验性方法[9]、[10]，这种方法无法考虑由特定碱基构象决定的复杂非线性动力学关系，导致切割效率难以预测。其次，Cas12a固有的单链识别模式给多指标检测带来了困难[11]、[12]，将多种Cas复合物混合在同一个反应体系中会导致信号串扰，无法实现多种标志物之间的协同“与”逻辑关系。第三，传统Cas12a的转录切割灵敏度遵循线性动力学规律，每个靶标分子只能激活有限数量的酶[13]、[14]，因此通常需要先进行预扩增处理才能达到临床检测所需的灵敏度，而这又会引入非特异性干扰并增加操作复杂性。综上所述，要克服这些相互关联的瓶颈问题，包括不合理的crRNA设计、单链检测逻辑以及较低的灵敏度，仍是推动基于CRISPR的检测技术向可靠的多miRNA分析发展的关键挑战。

深度学习作为一种数据驱动的方法，为理性设计CRISPR crRNA提供了有力支持，它能够识别出传统生物物理规则无法捕捉的复杂序列-活性关系[15]。例如，DeepCRISPR利用Transformer架构整合多组学数据来预测切割效率，其R2值高达0.92；而CRISPRO则通过深度迁移学习大幅缩短了设计周期[16]、[17]。在体外诊断领域，EasyDesign等平台也证明了卷积神经网络在筛选高活性crRNA用于病原体检测方面的有效性[18]。然而，现有的面向诊断的深度学习工具大多是基于需要具备典型PAM序列的长链双链DNA靶标进行训练的，以便满足后续的过滤算法要求。而先进的核酸传感器框架往往会产生缺乏天然PAM双链结构的短单链DNA中间触发链，传统的基因组预测工具无法准确处理或评估这些合成靶标，因此针对非典型单链DNA诊断靶标的计算型crRNA优化研究几乎尚未开展。

DNA逻辑门是一类成熟的生物计算框架，它们利用可预测的核酸杂交路径来执行复杂的布尔逻辑运算，从而将多指标检测结果转化为统一的诊断信号[19]、[20]。虽然传统的非酶促夹层置换式电路能够处理多靶标间的关联关系，但其在用于多指标检测时往往受到复杂的序列设计要求、缓慢的反应动力学以及明显的信号串扰问题的限制。而基于上游引物交换反应的逻辑门则是一种极具前景的替代方案。该逻辑门由沿合成的发夹模板移动的DNA聚合酶自主驱动，能够在恒定温度下逐步延伸引物，从而生成用户定义的单链DNA输出[21]、[22]。这种可编程的计算模型大大简化了序列设计流程，减少了不同路径间的信号串扰，为将多个miRNA输入整合为单一优化的分子触发剂提供了有效的解决方案。

为克服传统Cas12a检测方法存在的灵敏度限制，人们在CRISPR系统中设计自主的正反馈循环，以此实现信号的指数级放大。例如，CONAN系统就利用了一种工程化的scgRNA放大器，目标激活后的切割反应会释放出第二种经典的crRNA，进而招募并激活处于休眠状态的Cas12a[23]。此外，基于环状DNA底物的拓扑结构也可实现等温条件下的自催化扩增[24]。尤其是利用全长crRNA与分裂型crRNA之间的亲和力差异来促进对Cas12a蛋白的竞争，这一策略在CRISPR信号放大方面具有巨大潜力[25]、[26]。crRNA的恒定结构区域与目标互补的间隔区虽然可以物理上分离，但仍能重新组合形成具有活性的核糖核蛋白复合物。通过设计全长阻断链与动态组装的分裂型crRNA组分之间的亲和力层级，可以实现Cas12a的持续恢复与重新激活。不过，这类多组分级联反应的逻辑精确度与执行效率极易受到局部序列杂交热力学的影响，而借助深度学习进行序列预筛选，有望显著提升这类技术的稳定应用水平。

鉴于上述种种挑战，我们开发了一种干湿结合的集成诊断平台，该平台将数据驱动的深度学习序列优化、基于上游引物交换反应的AND逻辑门以及分裂型crRNA介导的自催化CRISPR扩增技术相结合，实现了对两种miRNA生物标志物的超高灵敏度与高特异性检测。首先，我们设计了名为DiagCRISPR的深度学习平台，该平台采用局部连接神经网络架构，能够精准模拟Cas12a的转录切割动力学过程。通过在后端加入虚拟PAM平均算法，DiagCRISPR成功突破了传统双链DNA的限制，能够对无PAM序列的短单链DNA诊断底物进行通用评分和滑动窗口扫描。其次，我们设计了由上游引物交换反应控制的AND逻辑门，用于处理miR-21和miR-155的同时存在情况，将多指标检测结果转化为单一的分子触发链。最后，这一优化后的触发链能够启动分裂型crRNA介导的竞争性扩增循环，推动Cas12a的不断循环利用与信号级联放大。整个集成检测流程使得两种目标miRNA的检测下限可达到皮摩尔级别，总分析时间不足2小时，且在复杂的临床血清样本中仍能保持极高的特异性和可靠的检测效果。这项工作建立了一种全新的检测范式，将深度学习驱动的序列-活性预测与可编程核酸电路紧密结合，为高级多指标分子诊断提供了可靠且可推广的方法。

内容片段

数据集构建与标准化

训练数据集来源于一个公开的Cas12a crRNA体外荧光检测数据集，该数据集完全来自无细胞转录切割实验[18]。每条记录包含一条引导序列（即PAM序列和crRNA间隔区的反向互补序列）以及一条目标编码链，同时还记录了20分钟和30分钟时的荧光检测数值。为确保标签的可靠性，我们排除了两个时间点之间荧光差异绝对值大于或等于0.5的样本，从而过滤掉了

DiagCRISPR平台的性能评估与功能验证

目前，基于深度学习的CRISPR Cas12a crRNA设计主要应用于基因编辑或常规病原体检测领域，相关算法通常针对具有严格典型PAM序列要求的长链双链DNA靶标进行优化[16]、[18]、[27]。然而，新兴的可编程体外分子诊断电路，包括基于上游引物交换反应的级联反应，往往依赖短单链DNA寡核苷酸作为中间触发链，来激活下游的Cas12a转录切割复合物。因为

结论

总之，我们成功开发了一种干湿结合的集成诊断平台，该平台将数据驱动的深度学习技术与可编程核酸电路相结合，实现了对两种miRNA的高精度检测。DiagCRISPR平台能够突破严格的PAM序列限制，从而实现对短单链DNA底物适配的crRNA的合理计算机辅助预筛选。通过将这种基于计算结果的序列选择方法与基于上游引物交换反应的AND逻辑门以及自催化CRISPR扩增网络相结合

CRediT作者贡献说明

吕雪飞：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源提供、项目管理、资金获取、正式分析、概念构思。刘颖：可视化、软件工具、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理、概念构思。杨俊远：撰写——初稿撰写、可视化、方法设计、实验研究、正式分析、概念构思。李安怡：方法设计、实验研究、正式分析、概念构思。蒋浩：可视化，

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

杨俊远|刘颖|蒋浩|李安怡|吕雪飞

北京工业大学医学科学与工程学院，中国北京100081