《Sensors and Actuators B: Chemical》：A Paper-based Colorimetric Biosensor for Small-Molecule Histamine Based on Synergistic Kinetic-Relay Aptamer Recognition and PtFe Nanozyme Signal Amplification
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摘要虽然基于适配体的生物传感器在检测小分子方面具有巨大潜力，但单个适配体的性能往往受到快速结合动力学与高亲和力之间固有矛盾的限制。为解决这一瓶颈，我们选择海产品中重要的食品安全指标组胺作为模型靶标，设计了一对具有协同作用的动力学中继适配体（SKRAP），该对适配体由两种针对组胺的
摘要
虽然基于适配体的生物传感器在检测小分子方面具有巨大潜力，但单个适配体的性能往往受到快速结合动力学与高亲和力之间固有矛盾的限制。为解决这一瓶颈，我们选择海产品中重要的食品安全指标组胺作为模型靶标，设计了一对具有协同作用的动力学中继适配体（SKRAP），该对适配体由两种针对组胺的适配体组成：一种具有高结合速率的快速捕获适配体（L2），另一种具有较高结合亲和力的稳定锁定适配体（HIS3-T2）。通过生物层干涉术和分子对接技术验证了这种协同动力学中继识别机制：L2凭借较高的结合速率迅速捕获组胺，而HIS3-T2则通过更稳定的多氢键相互作用依次捕获已解离的靶标，从而共同降低平衡解离常数和解离速率。随后，我们合成了一种具有强过氧化物酶样活性的PtFe纳米酶作为信号放大组件，并对其催化机制进行了深入研究。将SKRAP@PtFe复合物固定在壳聚糖/聚乙二醇改性的纸上，制成了基于智能手机的比色生物传感器。靶标诱导的SKRAP折叠会产生空间位阻，抑制纳米酶的催化作用，从而在10分钟内生成定量颜色信号。该生物传感器具有宽线性范围（3.05-781.25纳摩尔）和低检测限（2.21纳摩尔），能够高效、精准地检测原始及加工海产品中的组胺。除了组胺之外，这种协同动力学中继适配体对的设计还有望作为一种模块化传感工具，用于快速、灵敏地分析复杂实际样品中的其他小分子。
引言
由于具有高特异性、优异的化学稳定性、易于合成以及可多种方式修饰的特点，基于适配体的生物传感器在小型分子的分析与检测领域受到了广泛关注[1]、[2]。尽管具备这些优势，但单个适配体往往存在结合亲和力与结合动力学之间的固有矛盾[3]、[4]、[5]。高亲和力的适配体通常具有较慢的靶标捕获速率，会影响检测速度；而具有快速结合动能的适配体则往往存在快速解离且结合稳定性不足的问题。这种热力学与动力学之间的矛盾从根本上限制了基于适配体的生物传感器在检测小型分子方面的性能，尤其是在那些需要快速响应和稳定信号输出的实际检测应用中。
目前有一些关于适配体工程的研究试图通过多价结合策略来克服这一限制[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。例如，赵等人利用β-CD@AgNPs同时修饰拉曼信号分子4-MBA和多种适配体，用于检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇，其检测限可达0.032皮克/毫升[9]；黄等人则使用两种适配体检测四环素，检测限为0.0073纳克/毫升[10]。与单价适配体相比，多价适配体由于拥有更多的结合位点，能够在一定程度上提高适配体的亲和力。然而，这些方法存在设计不确定性，且缺乏合理的机制框架。因此，迫切需要合理设计出既能平衡亲和力又能兼顾动力学特性的新型适配体，实现一种协同识别机制，即一种适配体快速捕获靶标，另一种适配体则以高亲和力将其锁定。在本研究中，我们假设一种协同动力学中继适配体对（SKRAP）能够整合不同适配体的互补优势，形成高效的识别系统，从而有效解决传统的动力学与亲和力之间的矛盾，进一步提升生物传感器的性能。
在信号识别模块完成靶标识别后，还需要一个高效的信号转导元件才能产生可检测的输出。纳米酶作为一种具有天然酶类催化活性的纳米材料，因其出色的稳定性、可调控的催化性质以及比天然酶更强的抗变性能力，在分析化学中作为信号转导元件受到了广泛关注[12]、[13]、[14]。双金属纳米酶由于其两种金属组分之间的相互作用，往往能展现出协同效应。在贵金属与过渡金属结合形成的系统中，一种金属通常起到结构支撑的作用，另一种金属则负责表面修饰或晶格掺杂，从而使纳米酶具备多种功能[15]。以铂为基础的纳米酶以其优异的过氧化物酶样活性而广为人知，而铁则是一种成本较低的过渡金属替代品。因此，我们认为构建PtFe双金属纳米酶能够在保持高催化活性的同时提供足够的适配体结合位点，而且其合成方法简单、条件温和且易于大规模生产。当这类纳米酶被集成到基于纸的分析设备中时，能够实现低成本、便携、易于处理，并且可以与智能手机的信号检测功能相兼容，这些优点使其非常适合在资源有限的场合以及快速进行食品安全监测[12]、[16]、[17]。将适配体与双金属纳米酶相结合，可以实现目标明确的信号识别与转导的无缝衔接，从而便于构建用于快速检测的基于纸的生物传感器。
组胺是一种生物胺，由细菌分解海产品中的组氨酸以及在发酵或风干的海产品中产生，它是评估食品新鲜度和安全性的重要指标[18]。过量摄入组胺可能会引发过敏反应、胃肠道疾病，甚至危及生命的过敏性休克[1]。根据现行规定，美国食品药品监督管理局要求海产品中的组胺含量不得超过50毫克/千克（FDA，2011年）[19]。欧盟委员会则对鱼类和水产品中的组胺含量设定了严格的上限（通常为100或400毫克/千克），这就需要可靠的常规监测方法和分析技术。传统的组胺检测技术，如高效液相色谱法和毛细管电泳法，存在操作流程繁琐、仪器昂贵以及需要专业人员操作等缺点[19]、[20]。因此，开发一种快速、经济、易用且可在现场使用的组胺检测平台，对于在复杂的食品基质中检测组胺而言，仍然是一个亟待解决的难题。
在这项研究中，我们报道了一种基于纸的比色生物传感器，该传感器通过整合协同动力学中继适配体对（SKRAP）与具有高催化活性的PtFe纳米酶，实现了组胺的检测。SKRAP是通过将具有高结合速率的快速捕获适配体（L2）与具有高亲和力的稳定锁定适配体（HIS3-T2）相结合而合理设计的，本研究还利用生物层干涉术对该适配体的动力学中继机制进行了表征。之后，SKRAP与活性极高的PtFe双金属纳米酶结合，形成了一个纳米复合信号转导模块，同时我们也对PtFe纳米酶的优异形态结构及其过氧化物酶样催化活性进行了系统研究。这个集识别与转导功能于一体的模块通过层层自组装的方式固定在壳聚糖/聚乙二醇改性的纸上，从而能够产生可重复的比色信号。我们利用基于智能手机的比色分析软件对可见光颜色的变化进行定量分析，以实现快速智能监测。通过协同发挥SKRAP介导的动力学中继机制、双金属纳米酶的信号放大作用以及基于纸的检测平台的优势，本研究为解决基于适配体的分子识别中存在的结合速率与亲和力之间的矛盾提供了合理的解决方案，也为在复杂基质中快速检测小分子组胺提供了一种实用的方法。
章节节选
材料与试剂
所有的寡核苷酸均由上海桑根生物科技有限公司合成并通过高效液相色谱法纯化（见表S1）[1]、[21]。最初的L2适配体是由Mairal-Lerga等人设计的，其序列如下：ACAGGGAACG TGTTGGTTGC GGTTCTTCCG ATCTGCTGTG TTCT [21]，而HIS3-T2适配体则是在我们实验室之前的研究中构建并优化过的：TGAGCCCAAG CCCTGGTATG AATGGATTCT CGTTGGGCTG G [1]。选择这两种适配体是因为它们对组胺具有很高的特异性。组胺的化学文摘编号为：
用于检测组胺的基于纸的比色生物传感器的结构示意图
通过将设计的信号识别组件SKRAP与信号转导组件纳米酶相结合，我们就构建出了这种基于纸的生物传感器（见图1）。将适配体1（L2）与适配体2（HIS3-T2）共培养后，就可以形成SKRAP，随后再将它与PtFe纳米酶一起培养。首先，L2与靶标结合，实现初步捕获，但由于这种结合是短暂的，靶标有可能再次解离。之后，HIS3-T2则会对靶标进行锁定
结论
总之，通过将一种具有快速结合能力的适配体（L2，即捕获适配体）与一种高亲和力的适配体（HIS3-T2，即锁定适配体）合理结合，我们开发出了SKRAP适配体对，该适配体对有效地克服了单个适配体在识别能力上所受到的热力学与动力学之间固有矛盾的限制。通过系统的生物层干涉术表征，我们确认SKRAP相比传统适配体具有更高的表观亲和力、更快的结合动力学，同时其解离特性也得到了一定程度的抑制
CRediT作者贡献说明
Wen Zhu：方法设计、数据整理。Hong Chen：初稿撰写、结果验证、实验分析、正式分析、概念构思。Shutong Zhang：方法设计、正式分析。Yuyang Zhang：方法设计、实验研究。Jianan Sun：方法设计、实验研究。Jiao Li：结果验证、方法设计。Xiangzhao Mao：审稿与编辑、项目监督、项目管理、方法设计、资金获取、概念构思。Sai Wang：审稿与编辑、结果验证、项目监督
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（32422071；32225039；32372272）、山东省泰山学者计划（tsqn202408065）以及CARS专项基金（CARS-48）的支持。
Hong Chen|Wen Zhu|Yuyang Zhang|Shutong Zhang|Jiao Li|Jianan Sun|Sai Wang|Xiangzhao Mao
中国海洋大学食品科学与工程学院海洋食品加工与安全控制国家重点实验室，中国青岛市266404
