将近红外光驱动的耐氧ATRP技术与Y形DNA纳米结构相结合，用于miRNA-21的超灵敏电化学检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Integration of NIR Light-Driven Oxygen-Tolerant ATRP with Y-shaped DNA nanostructure for Ultrasensitive Electrochemical Sensing of miRNA-21

　　

摘要

原子转移自由基聚合技术（ATRP）已成为生物传感领域中一种强大的信号放大策略。然而，传统的ATRP系统对氧气极为敏感，需要复杂的脱氧处理，这不仅降低了实验的可重复性，还影响了其生物相容性。本文首次报道了一种基于近红外光（680纳米）驱动、耐氧性的ATRP技术，该技术通过亚甲蓝/铜双催化体系与Y形DNA纳米结构相结合来实现信号放大，从而能够超灵敏地检测多种固体肿瘤的关键生物标志物——miRNA-21。Y形DNA可自我组装在磁珠上，有效富集亚甲蓝光催化剂。在露天环境下的近红外光照射下，该光催化剂能促使铁烯标记的聚合物刷在金电极表面可控地原位生长，且无需进行任何脱氧处理；在近红外光照射下，反应溶液中的溶解氧几乎可在40分钟内被完全去除。这种双重放大策略（Y形DNA富集与光ATRP）使得检测范围可从0.1飞摩尔扩展到10?飞摩尔，最低检测限可达53阿摩尔。该传感器还具有出色的选择性、良好的重复性（相对标准偏差小于3.7%）、储存稳定性，以及在10%人血清环境中的抗干扰能力。这是首次将680纳米近红外光驱动的耐氧性亚甲蓝/铜双催化ATRP技术与Y形DNA纳米结构结合使用。通过将生物相容的近红外光聚合技术与核酸纳米技术相融合，这一平台为未来开发用于检测肿瘤相关miRNA及其他低丰度生物标志物的便携式即时检测装置提供了坚实的方法学基础。

引言

原子转移自由基聚合技术（ATRP）是一种高效的电化学生物传感信号放大策略[1]。它能够在电极表面原位生长高密度的聚合物刷，从而大幅增加电活性报告分子的数量，提升对肿瘤相关微RNA等微量生物标志物的检测灵敏度。不过，传统ATRP对氧气极为敏感[2]：分子氧会迅速猝灭正在传播的自由基，并氧化低价金属催化剂（如Cu(I)），导致聚合反应过早终止，进而使检测信号难以重复。因此，通常需要采用冷冻-抽气-解冻循环或长时间通入惰性气体等繁琐的脱氧处理方法。这些复杂步骤不仅会增加实验操作的难度、降低样本处理效率，还可能使核酸和蛋白质等脆弱生物分子发生变性或降解，严重限制了基于ATRP的生物传感器在复杂生物环境中的应用[3]。

为克服这些局限，研究人员最近开发出一种基于亚甲蓝/铜双催化机制、由近红外光驱动的耐氧性ATRP系统[4]。该系统无需脱氧即可在露天环境中实现可控的聚合反应，且与核酸具有良好的生物相容性。值得注意的是，亚甲蓝是一种价格低廉且可商业购买的光催化剂，而许多其他合成光催化剂则需要经过复杂的多步合成流程，难以实现大规模生产。此外，现有的大多数光ATRP系统仍依赖可见光或红光，这类光线的组织穿透能力较差，且光毒性相对较高。相比之下，近红外光（660-1100纳米）具有更强的穿透能力、更低能量，生物相容性更好，对生物分子的光损伤风险也更低。露天操作避免了苛刻的脱氧步骤，而低剂量的铜催化剂在体外检测中也几乎不会带来生物毒性风险。尽管有这些优势，但将680纳米近红外光驱动的耐氧性ATRP技术与基于核酸的信号放大策略结合用于电化学生物传感的研究至今尚未见报道。

微RNA是一类长度为19-25个核苷酸的小型非编码RNA，在转录后基因调控中起着关键作用。其中，miRNA-21在多种固体肿瘤中过度表达，包括结直肠癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌[5]。它通过靶向PTEN、PDCD4和TPM1等关键肿瘤抑制基因，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及上皮-间质转化过程。临床研究表明，miRNA-21水平升高与肿瘤进展程度、淋巴结转移以及患者预后不良密切相关，因此它被视为早期癌症诊断和预后监测极具潜力的生物标志物。然而，体液中的微RNA含量极低，且其序列同源性较高，给高灵敏度、高特异性检测带来了巨大挑战。为解决这一问题，人们开发了多种电化学传感平台，用于精准检测与疾病相关的生物标志物，为早期临床诊断提供了有力的分析工具[6]、[7]、[8]、[9]。

为了实现对低丰度微RNA的超灵敏检测，人们开发了多种无酶等温扩增策略，其中催化发夹组装技术因其简单性、高效性以及与复杂样品体系的兼容性而备受关注[10]。通过目标触发三种发夹DNA的催化发夹组装，可形成Y形DNA纳米结构，这种结构能够有效富集功能元件（如光催化剂或信号报告分子），同时降低非特异性背景信号，从而实现第一级的信号放大。

在本研究中，研究人员首次将680纳米近红外光驱动的耐氧性亚甲蓝/铜双催化ATRP技术与Y形DNA介导的催化发夹组装扩增策略相结合，用于miRNA-21的超灵敏电化学检测。与简单地将两种独立策略叠加不同，Y形DNA既可作为识别产物，也可作为亚甲蓝的富集载体，从而实现协同级联放大效应。如图1B所示，目标miRNA-21会促使HP1的发夹结构展开，生成miR-21-HP1复合物，同时暴露出原本被遮盖的结合位点。随后，HP2和HP3的茎环结构也会依次展开，最终形成稳定的Y形DNA纳米结构，同时释放出miRNA-21，启动新一轮的催化发夹组装反应。之后，经过氨基修饰的探针可将Y形DNA纳米结构固定在羧基功能化的磁珠表面。大量光催化剂则通过π-π堆叠作用嵌入到磁珠表面的Y形DNA结构之间（见图1A）。在近红外光照射下，富集后的亚甲蓝光催化剂会触发双催化循环，促使铁烯甲基丙烯酸酯聚合物刷在经BiBOEDS修饰的金电极表面可控地原位生长（见图1C）。这种双重放大策略——即Y形DNA/催化发夹组装富集与ATRP聚合生长——无需任何脱氧处理，就能将低丰度的miRNA-21信号转化为显著增强的电化学电流。更重要的是，这一放大策略大幅简化了电极表面的构建流程。所设计的近红外光聚合平台具有良好的耐氧性，且所使用的光催化剂亚甲蓝既可商业购买，又具备良好的生物相容性，为未来开发用于检测肿瘤生物标志物的便携式即时检测装置奠定了方法学基础。

章节节选

材料与设备

所有的核酸，包括发夹DNA1（HP1）、发夹DNA2（HP2）、发夹DNA3（HP3）、miRNA-21、miRNA-126、单错配RNA以及三错配RNA，均购自上海桑根生物科技有限公司，随后通过高效液相色谱法进行纯化。这些核酸的序列详见表S1。Tris-HCl缓冲液、羧基功能化的磁珠以及溴化铜则购自南京晶格化学技术有限公司。双[2-(2′-溴异丁酰氧基)乙基]二硫化物（BiBOEDS）

亚甲蓝/铜双催化近红外光驱动耐氧性ATRP的反应机制

如图2A所示，该电化学生物传感器中的信号放大依赖于亚甲蓝/铜双催化体系所实现的近红外光驱动耐氧性ATRP反应[11]。在近红外光照射下，处于基态的亚甲蓝离子会被激发至其三重态（3MB?*）状态[12]、[13]。这种激发态会通过过量的三(2-吡啶基甲基)胺作为牺牲电子供体而被还原猝灭，进而生成半还原态的亚甲蓝自由基（MB?）以及被氧化的TPMA自由基阳离子[14]。该

结论

综上所述，本研究通过将基于亚甲蓝/铜双催化体系的近红外光驱动耐氧性ATRP技术与磁珠表面的Y形DNA纳米结构介导的催化发夹组装技术相结合，成功开发出一种用于检测miRNA-21的超灵敏电化学生物传感器。这种双重放大策略使得聚合物刷能够在露天环境下无需脱氧即可原位生长，检测范围涵盖0.1飞摩尔到10?飞摩尔，最低检测限可达53阿摩尔。该传感器还表现出优异的选择性，

作者贡献说明

贾建航：负责原始论文撰写、结果验证、软件应用、正式数据分析以及研究概念构思。邹凌龙：负责实验方法设计及实验实施。周世金：负责论文审阅与编辑、实验指导、正式数据分析以及数据整理工作。孔金明：负责论文审阅与编辑、实验指导以及研究经费申请。张学吉：负责实验资源准备、项目管理工作以及研究经费申请。刘千瑞：负责论文审阅与编辑、实验指导、正式数据分析以及研究概念构思。

利益冲突声明

所有作者均声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关联关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：21974068）以及深圳市科技计划项目（项目编号：KQTD-20221101093605019）的支持。

Jianhang Jia|Shijin Zhou|Linglong Zou|Jinming Kong|Qianrui Liu|Xueji Zhang

江苏省南京市南京科技大学环境与生物工程学院，邮编210094，中国