《Separation and Purification Technology》：Process combining fermentation and nanofiltration for the production of biobased 2,3-butanediol
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摘要基因工程领域的最新进展使得人们能够培育出能够大量合成生物基化学品的微生物。例如，经过基因工程改造的Klebsiella oxytoca KMS006菌株，可从200克/升的葡萄糖中生产出高达86克/升的2,3-丁二醇，其产量为每消耗1克葡萄糖可产出0.42克2,3-丁二醇。不
摘要
基因工程领域的最新进展使得人们能够培育出能够大量合成生物基化学品的微生物。例如，经过基因工程改造的Klebsiella oxytoca KMS006菌株，可从200克/升的葡萄糖中生产出高达86克/升的2,3-丁二醇，其产量为每消耗1克葡萄糖可产出0.42克2,3-丁二醇。不过，如何高效地分离出目标产物仍是确保该工艺可行性的关键难题。本研究探讨了纳米过滤技术用于分离2,3-丁二醇与其它副产物的潜力。研究采用了合成培养液和实际发酵液，通过NF270膜来检测2,3-丁二醇、琥珀酸和乙酸的转移效率及纯度。研究人员设计了一种结合浓缩模式和渗滤模式的两阶段工艺，以此实现高纯度且高产量的2,3-丁二醇回收。将该工艺应用于实际发酵液后，2,3-丁二醇的回收率为88%，最终纯度达到96重量%，而发酵液初始纯度仅为79重量%，最终共获得了126克的2,3-丁二醇。这些结果表明，纳米过滤是一种从复杂的发酵混合物中提取高价值生物基化学品的有效方法，对后续加工具有重要意义。
引言
随着化石燃料日益稀缺，人们开始寻求利用可再生资源来生产化学品的替代方法。在这一背景下，2,3-丁二醇因其在化妆品、制药、橡胶、燃料和树脂等多个行业中的多种应用而备受关注[1]、[2]、[3]、[4]。经济预测显示，到2027年，全球2,3-丁二醇市场的规模将达到约2.2亿美元[5]，这进一步凸显了其在生物基化学品领域的重要性。由于通过微生物发酵生产2,3-丁二醇具有环境友好和经济效益，因此人们更倾向于使用可再生原料，这也是传统化石燃料基生产流程的理想替代方案。
在微生物合成方面的研究中，已经发现多种能够将可再生底物转化为2,3-丁二醇的微生物。包括Bacillus spp.、Klebsiella pneumoniae以及Klebsiella oxytoca在内的细菌菌株，因其高效的2,3-丁二醇生产能力而成为研究重点[3]、[4]。其中尤为突出的是经过基因工程改造的Klebsiella oxytoca KMS006菌株，它能够以0.42克/克的产量，从200克/升的葡萄糖中生产出86克/升的2,3-丁二醇，展现出极高的生产效率[6]。尽管发酵技术已取得诸多进展，但从发酵液中分离出2,3-丁二醇仍然是一项艰巨任务。发酵液通常包含复杂的盐类及其他有机化合物，因此需要开发既技术上可行又经济上合理的后续分离工艺。
为了解决2,3-丁二醇的回收与纯化问题，人们研究了多种后续处理方法，包括溶剂萃取、反应萃取、诱导相分离、吸附以及膜分离技术[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。基于萃取的方法可将2,3-丁二醇从发酵液中转移到另一相中进行选择性回收和浓缩。反应萃取以及空心纤维膜辅助的液液萃取方法的回收率可达95%左右，对应的产品纯度分别为99重量%和97.1%[10]、[11]，但这两种方法都需要对溶剂或萃取剂进行回收和再利用。诱导相分离方法的回收率最高可达85.5%[12]，不过该方法需要添加无机盐和有机溶剂。吸附技术也表现出优异的分离性能，通过循环纳米MFI吸附技术，2,3-丁二醇的回收率可达95%，纯度为93重量%；而模拟移动床吸附技术则无需使用解吸剂即可实现近乎完全的回收，2,3-丁二醇的回收率为80重量%[9]。尽管这些方法效果不错，但它们通常需要添加化学试剂、对溶剂或解吸剂进行回收再利用、对吸附剂进行再生处理，或者还需要额外的纯化步骤，从而增加了工艺的复杂性和运营成本[7]。正因如此，膜分离技术作为一种具有低能耗、温和的操作条件、模块化设计以及高选择性的技术，逐渐成为分离复杂发酵液的理想替代方案。在各类膜分离技术中，纳米过滤技术因其在分离2,3-丁二醇方面的出色表现而备受瞩目。事实上，纳米过滤技术已被成功用于其他发酵产品的回收，比如从Escherichia coli KJ112菌株中提取的琥珀酸，其纯度可达99.5%，回收率超过92%[13]。最新的研究表明，NF270膜具备良好的分离性能，它能有效分离2,3-丁二醇，因为该膜对目标物质的溶质保留率较低，而对杂质的保留率较高，同时还有不错的渗透通量[14]。在本研究中，研究人员探讨了一种结合发酵与进一步纯化的2,3-丁二醇提取工艺。首先，利用经过代谢工程改造的K. oxytoca KMS006菌株通过发酵生产2,3-丁二醇，然后使用NF270纳米过滤膜将其与主要的发酵副产物——琥珀酸、乙酸以及磷酸盐分离。研究人员设计了两步纳米过滤工艺：第一步为浓缩模式，使2,3-丁二醇保留在渗透液中；第二步为渗滤模式，在不影响纯度的前提下进一步提高渗透液中2,3-丁二醇的浓度。该工艺首先在成分逐渐复杂的合成发酵液中进行了测试，从单一组分溶液逐步过渡到多组分溶液，之后才应用于实际发酵液。本研究的目的是确定该两步工艺的最佳操作条件，从而实现2,3-丁二醇的高产量和高纯度。
章节节选
用于发酵的微生物
本研究使用了由Jantama等人之前培育的、经过代谢工程改造的Klebsiella oxytoca KMS006菌株（ΔadhE-Δack-ptaΔldhA）。该菌株的种子培养物在含以下成分的Luria-Bertani（LB）培养基上于4摄氏度保存：蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升，氯化钠5克/升，琼脂20克/升。KMS006菌株的储备培养物则是在含有甘油（比例为1:1）的培养基中保存的。矿物盐培养基（AM1）是根据Martinez等人的研究结果改进而来的，被用作该研究的基础培养基。
使用K. oxytoca KMS006菌株进行葡萄糖发酵
本研究中的发酵性能评估是使用经过代谢工程改造的K. oxytoca KMS006菌株进行的，该菌株通过抑制其他竞争性代谢途径，从而最大化2,3-丁二醇的产量。该菌株源自KMS004和KMS002菌株，前者被设计用于抑制乙醇的产生，后者则用于抑制乙酸的产生。此外，KMS006菌株还被专门设计为无法生成乳酸[6]。实验结果证实，该菌株确实能够高效生产出高浓度的2,3-丁二醇。
结论与未来工作
本研究设计并评估了一种基于两步纳米过滤技术的纯化工艺，用于从含有乙酸、琥珀酸和磷酸盐等杂质的发酵液中提取2,3-丁二醇。该工艺首先通过浓缩模式，然后再通过渗滤模式，使用在20巴压力下运行的NF270膜，通过尺寸排阻作用和静电保留作用相结合的方式，有效地将2,3-丁二醇与其带电杂质分开。这种两步工艺
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
作者感谢Royal Golden Jubilee博士奖学金（资助编号PHD/0066/2559）为Weeranat Sakunlikharetsima在攻读博士学位期间提供的经济支持。此外，这项研究还得到了以下机构的资金支持：(i)苏兰纳瑞理工大学（SUT），(ii)泰国科学研究与创新机构（TSRI），以及(iii)国家科学、研究与创新基金（NSRF），资助编号为NRIIS No. 204171（FF3-304-68-12-95(B)）。
Weeranat Sakunlikharetsima|Kaemwich Jantama|Claire Joannis Cassan|Patricia Taillandier|Helene Roux-de Balmann|Kaemwich Jantama|Sylvain Galier
法国图卢兹大学，法国国家科学研究中心，图卢兹理工学院，LGC公司，图卢兹
