《FEBS Letters》：Discerning protein pools by selective staining with self-labeling tags
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跨膜细胞表面蛋白需经历从内质网合成位点到质膜的成熟过程，并可被内吞回细胞内部。显微镜技术可在空间上区分细胞表面与胞内区室中的蛋白群体，监测其转运过程并解析不同亚群的丰度差异。SNAP-tag、HTP及FAST等蛋白标签，结合其对应的（不）可渗透荧光染料偶联配体
跨膜细胞表面蛋白需经历从内质网合成位点到质膜的成熟过程，并可被内吞回细胞内部。显微镜技术可在空间上区分细胞表面与胞内区室中的蛋白群体，监测其转运过程并解析不同亚群的丰度差异。SNAP-tag、HTP及FAST等蛋白标签，结合其对应的（不）可渗透荧光染料偶联配体，为区分胞内与胞外蛋白亚群提供了新的技术路径。在染料-配体分子中引入可切割基团，可通过 stripping 剩余表面亚群实现对内吞亚群的检测。荧光寿命成像显微镜（FLIM）与亮度解混等最新技术进展，进一步拓展了显微镜在蛋白动态研究中的应用潜力。
缩写
本文涉及的缩写包括：AF（AlexaFluor）、AMPAR（α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体）、BG（O6-苄基鸟嘌呤）、CA（氯烷）、CLUSTER（化学标签解折叠剪接介导重组技术）、D2R（多巴胺受体D2）、DNA-PAINT（DNA纳米尺度拓扑累积成像技术）、dSTORM（直接随机光学重建显微镜）、ER（内质网）、F2X（二氟呫吨）、FAST（荧光激活与吸收偏移标签）、FLEXTAG（先进通用纳米显微镜用可交换抗X标记荧光标记技术）、FLIM（荧光寿命成像显微镜）、FRET（F?rster共振能量转移）、GLP1(R)（胰高血糖素样肽1受体）、GPCR（G蛋白偶联受体）、HBR（羟基苄叉罗丹宁）、HTL（HaloTag配体）、HTP（HaloTag蛋白）、JF（JaneliaFluor）、MESNA（2-巯基乙磺酸钠）、mGluR（代谢型谷氨酸受体）、OG（俄勒冈绿）、POI（目标蛋白）、SiR（硅罗丹明）、SS（二硫键）、STED（受激发射损耗显微镜）、STORM（随机光学重建显微镜）、TM（跨膜）、TMR（四甲基罗丹明）、TrkB（原肌球蛋白受体激酶B）。
蛋白亚群及其周转的生理意义
人类基因组编码超过20000种蛋白质，其通过可变剪接与翻译后修饰产生多种变体，执行多样化的生物学功能。蛋白质的表达模式决定了细胞的特定功能，并可作为细胞类型鉴定的依据。即使是同一细胞类型，其表达谱也存在异质性，而高度动态的系统进一步催生了不同蛋白亚群的生成与循环。单细胞RNA测序与蛋白质印迹技术仅能提供蛋白质转录或表达的静态快照，而显微镜技术则是定位分析的首选方法，其空间分辨率目前已可达数十纳米级别。本综述重点阐述标记策略、化学染料与配体工程以及多重成像技术的最新进展，这些技术共同推动了亚细胞精度下多蛋白群体的同步研究。
细胞表面受体从合成位点到作用位点的转运过程受到严格调控，对细胞正常功能至关重要。蛋白质在内质网（ER）中合成并经历N-连接与O-连接糖基化、磷酸化及泛素化等翻译后修饰，这些修饰可增强蛋白稳定性，是其转运与功能发挥的关键。完成功能构象折叠后，蛋白质被包裹进囊泡转运至高尔基体进行进一步加工，最终通过运输囊泡递送至质膜。整合至细胞膜的受体（主要包括离子通道、受体偶联酶及G蛋白偶联受体（GPCR））可感知胞外刺激并启动胞内信号转导（尽管信号转导并不完全局限于细胞表面）。受体激活并启动信号转导后通常会发生内体化，随后被靶向溶酶体降解或分选回收至细胞表面。这些过程在细胞内形成了至少两类功能与非功能蛋白亚群：胞内亚群，包括驻留在内质网与高尔基体的未成熟蛋白，以及从质膜内吞后等待降解或回收的成熟蛋白；胞外暴露/细胞表面亚群，即锚定在质膜上、可被胞外配体结合并具备信号启动能力的完全加工成熟蛋白。
解析膜转运通路相关的细胞与分子机制，对于攻克神经退行性疾病、代谢性疾病（如阿尔茨海默病与2型糖尿病）具有重要意义。神经元与胰腺β细胞虽在解剖位置与形态上存在差异，但均具有兴奋性且共享相似的胞吐机制。此外，胰岛素抵抗已被证实是痴呆的明确风险因素，提示2型糖尿病与阿尔茨海默病之间存在病理关联。
多种细胞表面受体在上述两类细胞中均有表达并发挥功能，例如离子型α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPAR）的亚基2与3、受体偶联酶原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）以及GPCR家族的胰高血糖素样肽1受体（GLP1R）。这些受体均经历动态转运过程，并参与疾病发生发展。AMPAR经历快速的组成型与活动依赖性转运，其突触后膜密度与兴奋性突触传递强度呈正相关，其“周转率”是突触稳态的关键决定因素。在β细胞中，AMPAR通过锚定胰岛素颗粒参与胰岛素分泌。TrkB通过调节突触可塑性影响记忆与情绪，其信号转导或转运障碍会导致记忆缺陷与精神障碍，是极具潜力的治疗靶点；β细胞特异性敲除TrkB会导致糖耐量受损与胰岛素分泌减少。GLP1R是2型糖尿病与肥胖治疗的重要靶点，可在高糖条件下调节β细胞胰岛素释放并调控下丘脑饱腹感。GLP1R被激动剂激活后会发生内吞，而维持其在细胞膜上的滞留可增强长效胰岛素释放。因此，研究受体转运动力学与内吞速率对于理解其信号特性与治疗潜力至关重要。针对上述靶点，光学分辨蛋白亚群是解析蛋白转运、信号动态及其功能生命周期的关键。
标签与配体
共聚焦、宽场及超分辨显微镜最常用的标记工具由两部分组成：与目标蛋白（POI）融合表达的遗传编码自标记蛋白标签，以及偶联（高性能）荧光基团的生物正交合成配体。荧光基团通常选择可见光光谱范围内的染料，涵盖紫外至远红光（对应激光波长如405 nm、488 nm、561 nm与638 nm），并需避免光谱重叠。短波长荧光基团在技术上可提供更高分辨率，但组织自发荧光较强会影响成像质量；远红光荧光基团具备更深的组织穿透深度与更低的光毒性，但其荧光量子产率通常较低。与传统的荧光蛋白（如GFP）相比，化学-遗传杂交标记策略具有更高的光化学灵活性与稳定性，但缺点是需要外源添加荧光物质进行可视化。
目前已发展出多种蛋白标记系统，本文重点介绍三种在多项实验中广泛应用的主流系统。HaloTag蛋白（HTP）是一种33 kDa的修饰卤代烷脱卤酶，可与含氯烷（CA）的HaloTag配体（HTL）形成共价酯键，具有扩散控制的快速反应动力学与配体超高稳定性，已被应用于自噬流活体检测等研究。SNAP-tag是20 kDa的人DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的突变体，可快速不可逆地与苄基鸟嘌呤（BG）衍生物反应，已应用于体内细胞消融与离体受体转运研究。然而，SNAP-tag与HTP标记系统的不可逆性在显微镜成像中可能成为限制因素，因为高激光功率会导致共价连接的荧光基团光漂白。尽管如此，这两种标签在基于CRISPR的基因敲入小鼠模型中具有显著优势，可实现内源性蛋白可视化并避免过表达导致的折叠、转运动力学与信号偏向性 artifacts。其他标签系统则提供了更多重多重标记的可能性，例如可与O2-苄基胞嘧啶反应的CLIP-tag、以非共价高亲和力结合甲氧苄啶的eDHFR（以及近期报道的FLEXTAG）、以及ybbR、ALFA、HA与Spy-tag等短肽标签。值得注意的是，可交换蛋白标签支持成像过程中荧光染料的持续替换，从而克服光漂白问题。其中，14 kDa的荧光激活与吸收偏移标签（FAST）通过可逆结合非荧光荧光原发挥作用，结合后荧光显著增强且吸收光谱红移，可实现高对比度成像；其可逆性还赋予了“关闭”荧光的独特优势，通过洗脱配体实现动态标记。此外，基于HTP开发的BenzoTag、OrthoTag与F2X系统，以及基于SNAP-tag/分裂内含肽融合设计的CLUSTER系统，进一步丰富了标记工具箱并降低了标签尺寸。
利用不可渗透性策略
当跨膜POI与所选标签融合并同时分布于胞内与胞外空间时，下一步需选择合适的荧光基团。许多高性能有机染料具有膜渗透性，可进入胞内区室，导致非特异性背景染色及染料在胞质或其他区室的累积。针对这一问题，研究人员通过荧光原性策略进行了优化，典型代表包括硅罗丹明（SiR）、JaneliaFluor与MaP系列染料。另一种策略是利用酶促反应激活荧光，例如Urano实验室开发的基于荧光素的俄勒冈绿（OG）半乳糖衍生物，可在γ-谷氨酰转肽酶（GGT）处理后激活荧光。然而，上述策略仍会标记所有（表面暴露、生物合成途径、内吞与回收）膜蛋白亚群。在受体功能研究中，通常仅需关注细胞表面蛋白以解析其药理学特性、信号转导、内吞速率与周转。因此，研究人员依赖不可渗透染料（如Alexa Fluor 488、568或647）进行特异性细胞表面“脉冲”标记，随后使用可渗透荧光基团进行“追踪”标记，从而区分胞内亚群。研究人员已构建了HTP-TM-SNAP与SNAP-TM-HTP（TM=跨膜）两种融合蛋白作为脉冲追踪实验的基准工具，其表达后可使一个标签暴露于胞外，另一个保留在胞内。
然而，受激发射损耗（STED）与随机光学重建显微镜（STORM）等超分辨技术对染料选择提出了更高要求。例如，在STED中表现优异的SiR-d12在STORM中缺乏足够的光闪烁特性，而STORM常用的Cy5在STED中则易快速光漂白。因此，不可渗透性策略需根据具体的光学实验需求进行设计。Jonker等人通过在高性能罗丹明类JF635-HTL上引入两个羧酸基团，开发了细胞不可渗透的JF635i-HTL（i=impermeable），可在内吞回收实验与长期孵育实验中稳定应用。另一种化学策略是在可渗透的Cy5-HTL上引入带负电的磺酸基，利用磺酸基的亲水性与静电排斥作用阻止配体穿过疏水性脂质双分子层。磺酸基可修饰在染料本身（得到SulfoCy5-HTL），也可修饰在配体上（得到Cy5-SHTL，读作“shuttle”）。对于SNAP-tag，高性能配体-荧光基团对BG-SiR-d12可通过引入磺酸化BG转化为不可渗透的SBG-SiR-d12。该磺酸基在SNAP-tag催化反应后作为离去基团，最终释放的荧光基团与BG-SiR-d12完全相同，且光物理特性保持不变。
使用磺酸基介导的膜排斥染料时，应避免长时间孵育，因为动力学因素会导致探针随时间推移逐渐在胞内累积，干扰内吞蛋白的定量。可通过缩短标记时间、使用内吞抑制剂（如dynasore、巴佛洛霉素A1、Pitstop或Pitstop2）以及4°C低温标记等措施降低该效应。此外，通过比较标记后立即（t=0）与延长孵育后的胞内信号，可评估探针的时间依赖性内吞情况。SBG-TMR与BG-SiR已被用于CHO-K1细胞中稳定表达的SNAP-GLP1R的脉冲追踪实验，以追踪Exendin-4刺激后的受体转运。磺酸化BG衍生物在胰腺朗格汉斯胰岛内分泌微器官的内源性CRISPR/Cas9 SNAP基因敲入GLP1R胞外域活体标记中发挥了关键作用，可特异性标记胞外亚群，而可渗透的BG-SiR主要标记胞内亚群。研究证实GLP1R是胰岛素分泌β细胞的特异性标志物，利用SBG-TMR可追踪受体在多种肽类激动剂（如Exendin-4、司美格鲁肽与替尔泊肽）作用下的内吞动态，揭示GLP1R动力学的异质性。利用BG-Sulfo549配体结合非天然氨基酸光笼ONBY的策略，可在蓝光照射下实现无清洗低浓度标记。值得注意的是，由于溶解性更高，SBG-SiR-d12在SNAP-Unc13a基因敲入小鼠固定透化脑片成像中表现优于BG-SiR-d12，背景更低且信号更强。此外，FAST标签也开发了磺酸化羟基苄叉罗丹宁（HBR）配体，被用于流式细胞术分析多巴胺受体D2（D2R）的膜转运，以解析D2R突变体的转运缺陷。
磺酸化HaloTag配体（SHTLs）在超分辨成像与mGluR2稀疏标记中的应用
SHTL策略成功应用于SiR-d12-SHTL及新一代HTL.2的双磺酸化修饰，得到ATTO 647N-S2HTL.2。前者被用于标记并成像慢病毒转导海马神经元中定位于胞外的HTP-代谢型谷氨酸受体2（HTP-mGluR2，一种神经调节型GPCR）。通过共聚焦成像与bassoon（突触前）及SHANK2（突触后）抗体共染验证，该受体池主要富集于突触前膜。由于SiR-d12具有优异的亮度与光稳定性，STED纳米成像可解析HTP-mGluR2阳性神经突的精细突触旁结构，分辨率达134 nm。ATTO 647N-HTL.2的双磺酸化修饰（ATTO 647N-S2HTL.2）有效克服了染料固有的非特异性粘附特性。在HTP-SNAP-mGluR2转染的HEK293T细胞中，非磺酸化版本出现非特异性结合，而双磺酸化版本则呈现清晰的细胞表面信号。HTL.2第二代标签支持低浓度标记，在稀疏转染系统（DNA用量仅为常规12.5%）与短时间标记（固定前10分钟）条件下，1 nM的标记浓度即可检测到清晰的HTP-mGluR2信号。上述案例充分证明了磺酸化策略在不同系统中的广泛适用性。
细胞表面标签的去除
另一种研究细胞表面受体转运事件的策略是使用自标记蛋白标签的可切割底物。该底物具有不可渗透性，仅标记细胞表面的受体。当受体发生激动剂诱导的内吞与胞内转运后，会形成未内吞受体与内体/溶酶体系统受体两个亚群，前者会干扰对内吞蛋白亚群动力学的研究。为此，研究人员在染料与不可渗透底物之间引入二硫键（SS）作为连接臂，例如SulfoCy5-SS-HTL。该二硫键可被不可渗透还原剂MESNA（2-巯基乙磺酸钠）切割。经15分钟短时孵育，MESNA可快速不可逆地 stripping 掉仍驻留在质膜上的受体荧光标签，仅保留内吞受体亚群的标记。该方法可在活细胞或固定细胞中研究内吞亚群的回收动力学并进行内吞定量。但需注意，MESNA虽被广泛认为不可渗透，但在长时间孵育、高浓度或膜完整性受损条件下仍可能进入胞内。此外，还原条件可能切割天然二硫键，因此实验设计中必须设置无MESNA对照组、不可切割类似物对照组以及细胞活力检测（如WST-1）作为质控。
更多可能性与未来展望
上述策略可扩展至多目标蛋白的同时多重标记。例如，将一个POI与SNAP-tag融合，另一个POI与HTP融合，利用各自对应的光谱区分荧光底物即可实现并行可视化。该方法可用于分析共内吞与共定位，研究人员已利用该策略研究mGluR同源与异源二聚体的共定位。在HEK293T细胞中共表达SNAP-mGluR2与HTP-mGluR3，分别用可切割荧光探针BG-SS-SulfoCy3与HTL-SS-SulfoCy5标记，谷氨酸刺激后仅含mGluR3的二聚体发生内吞，随后用MESNA清除剩余表面荧光，即可清晰观察胞内区室中的转运受体。通过线扫描分析可评估受体共定位，并利用受体漂白F?rster共振能量转移（FRET）技术验证受体异聚化，该技术要求供体与受体距离在3–10 nm范围内。
不同的分离策略
共聚焦、宽场与超分辨显微镜虽是强大的多重分析工具，但受限于可用光谱通道数量（通常为4个）。荧光寿命成像显微镜（FLIM）基于荧光平均寿命区分发色团，可在单一光谱通道中使用多种荧光基团（如Cy5与ATTO 647N），实现多细胞靶标的分离。研究人员已利用不同HTP变体与两个光谱通道，在活细胞中实现了6个靶标的光谱分辨检测。FLIM还可用于区分胞内与胞外蛋白亚群：将不同自标记标签（如SNAP-tag与HTP）与POI融合，通过脉冲追踪策略在单一光谱通道中用可渗透与不可渗透底物分别标记，即可实现蛋白亚群的并行可视化，使检测靶标数量较传统显微镜翻倍甚至三倍。但需注意，荧光寿命受pH、离子浓度与黏度影响，选择发色团时需谨慎考虑胞内与胞外微环境的差异，避免将寿命差异错误归因于蛋白亚群。此外，FLIM对光子通量要求较高，需选择高量子产率与高光稳定性的染料以确保测量准确性。
光谱解混技术（SD-STORM）与DNA-PAINT为多重标记提供了额外工具。这些技术可在单一激光激发下，基于固有光子通量（强度）区分同一发射光谱内的多种染料（如ATTO 647N与ATTO 680）。研究人员已利用SD-STORM仅通过单通道实现了微管、网格蛋白与波形蛋白三种细胞靶标的三色超分辨成像。与FLIM类似，SD-STORM对光子通量要求极高，染料筛选难度大，且长成像时间易导致光漂白与样本漂移，需要高精度的通道校准工具与软件支持。相比之下，DNA-PAINT技术实现难度更低，技术要求更友好，但其仅适用于固定样本，且若需抗体偶联则会产生显著的连接子误差。该概念已被拓展至自标记蛋白领域，研究人员开发了HaloTag的可交换配体（xHTLs），实现了HaloTag与“PAINTing”技术的兼容。
总结
现代显微镜技术拥有多种强大工具，可通过视觉分辨蛋白亚群来研究跨膜蛋白动态。蛋白标签与可渗透/不可渗透配体结合的脉冲追踪策略可实现精准标记，而超分辨显微镜、FLIM与光谱/亮度解混技术进一步提升了并行分析能力。本综述概述了该领域的最新进展，展示了广阔的技术应用前景，并期待未来更多创新方法的涌现。
作者贡献
KF：可视化，撰写—初稿。JB：经费获取，监督，可视化，撰写—初稿。
致谢
本项目获得欧盟“地平线欧洲”框架计划资助（deuterON， grant agreement no. 101042046，授予JB）。开放获取费用由Projekt DEAL支持。
