外周溶酶体将PLEKHG3招募至黏着斑并抑制突起动力学

《FEBS Letters》：Peripheral lysosomes recruit PLEKHG3 to focal adhesions and restrain protrusion dynamics

　　

溶酶体是动态细胞器，通过将胞质分子招募至其限制膜上的蛋白平台来调控代谢信号。研究人员使用邻近标记技术定义了LAMTOR3（一种控制mTORC1信号和溶酶体定位的Ragulator支架组分）的相互作用蛋白和邻近蛋白。该筛选获得了多个先前未被重视的相互作用蛋白，包括一个肌动蛋白重塑网络。在本研究中，研究人员将RhoGEF PLEKHG3表征为LAMTOR3的邻近蛋白，该蛋白与外周溶酶体及皮层F-肌动蛋白在黏着斑（FA）位点共定位。强制溶酶体外周分散导致PLEKHG3在黏着斑处积累，并在野生型和PLEKHG3缺陷细胞中均降低突起活性。因此，溶酶体定位既控制PLEKHG3的定位也控制突起活性，但突起变化可独立于PLEKHG3发生。

**论文解读：外周溶酶体招募PLEKHG3至黏着斑并抑制突起动力学**

**研究背景与问题**
溶酶体传统上被视为降解细胞代谢废物的酸性细胞器，但近年研究发现其限制膜可作为信号平台，通过动态招募胞质蛋白参与代谢调控和细胞器通讯。LAMTOR复合体（又称Ragulator）是锚定于溶酶体表面的五聚体复合物，负责整合mTORC1激活、MEK/ERK信号、AMPK信号、溶酶体大小调控及细胞骨架收缩性等多种功能，并调控溶酶体定位。溶酶体的空间定位影响其理化性质：外周溶酶体积累与mTORC1激活增强、黏着斑（FA）位点结合相关，并参与质膜融合过程（如抗原呈递、膜修复及溶酶体胞吐），对癌细胞迁移至关重要。然而，溶酶体如何通过瞬时或邻近蛋白与细胞骨架重塑网络耦合尚不明晰。此前，邻近依赖标记方法（如BioID、APEX）已用于鉴定溶酶体相关蛋白，但受限于标记时间、细胞毒性或诱饵选择。本研究采用TurboID邻近标记法，以LAMTOR3（L3）为诱饵，系统鉴定其胞质邻近蛋白，旨在揭示溶酶体在肌动蛋白重塑中的新角色。

**研究内容与结论**
研究人员在《FEBS Letters》发表论文，通过TurboID邻近标记结合质谱（MS）分析，鉴定出LAMTOR3的邻近蛋白网络，其中RhoGEF家族成员PLEKHG3为高置信度候选。进一步实验表明，PLEKHG3与LAMTOR3为瞬时邻近关系而非稳定结合，其与溶酶体在黏着斑及细胞突起处共定位。强制溶酶体外周分散（通过KIF1A过表达）可集中PLEKHG3至质膜，但降低突起形成和细胞迁移活性，且该效应在PLEKHG3敲除细胞中仍存在，提示PLEKHG3非必需。该研究揭示了溶酶体定位通过调控PLEKHG3分布影响细胞突起动力学的新机制，为理解溶酶体在细胞运动中的功能提供新见解。

**主要技术方法**
1. **TurboID邻近标记筛选**：在HEK293T细胞中建立稳定表达C端或N端V5-TurboID标记的LAMTOR3（L3-T-V5或V5-T-L3）的细胞系，以GFP-NES（V5-CYTO）为胞质对照，TMEM192（V5-LYSO）为溶酶体定位对照，经生物素处理10-15分钟后，通过链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白，进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，结合MaxQuant和DEqMS进行定量及差异表达分析。
2. **免疫荧光（IF）与活细胞成像**：使用HeLa细胞（人宫颈癌细胞系）进行固定细胞免疫荧光染色（PLEKHG3、LAMP1、Paxillin、Vinculin等抗体），以及活细胞成像（LysoTracker标记溶酶体，GFP-PLEKHG3标记PLEKHG3），通过共聚焦或转盘共聚焦显微镜观察亚细胞共定位和动态行为。
3. **基因编辑与表达调控**：采用CRISPR/Cas9敲除（KO）PLEKHG3或LAMTOR3，以及siRNA敲低（KD）策略；通过过表达mCherry-KIF1A（驱动溶酶体外周运输）或RUFY3-mCherry（促进溶酶体内向运输）操纵溶酶体定位。
4. **生物化学验证**：链霉亲和素下拉（streptavidin pulldown）结合免疫印迹（IB）验证PLEKHG3与L3的邻近关系；V5免疫沉淀（IP）检测蛋白-蛋白相互作用。
5. **形态计量与统计分析**：使用ImageJ软件进行图像分析，包括FA结构分割、细胞轮廓测量、荧光强度分布定量；采用非参数Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验进行统计比较。

**研究结果**
**1. 邻近依赖标记揭示LAMTOR3与肌动蛋白重塑网络的相互作用**
通过TurboID筛选，研究人员鉴定出L3的已知相互作用蛋白（如LAMTOR复合物亚基、BORC复合物、SLC38A9等）及新候选蛋白，其中PLEKHG3（具有RhoGEF活性的肌动蛋白结合蛋白）在两种标签方向（C端和N端）的筛选中均表现为高置信度富集。基因本体富集分析（ORA）显示，L3邻近蛋白群包括“肌动蛋白结合”和“肌动蛋白细胞骨架”相关类别，提示L3与肌动蛋白重塑网络的新关联。
**2. PLEKHG3是LAMTOR3的邻近蛋白并与细胞突起处的外周溶酶体共定位**
免疫印迹验证了PLEKHG3在链霉亲和素下拉中被L3诱饵富集，但V5免疫沉淀未检测到直接相互作用，表明其瞬时邻近性质。在HeLa细胞中，内源性PLEKHG3与LAMP1阳性溶酶体在质膜下共定位，尤其富集于伸长型的突起结构中。GFP-PLEKHG3与Vinculin标记的黏着斑及皮层F-肌动蛋白共定位，且LAMP1阳性囊泡同样出现在这些部位。
**3. PLEKHG3与溶酶体在黏着斑位点共定位独立于LAMTOR3**
在LAMTOR3敲除（L3 KO）细胞中，虽然LAMTOR复合物解体，但GFP-PLEKHG3仍定位于Paxillin阳性的黏着斑，且与LAMP1囊泡的共定位不受影响；L3 KO细胞仅表现出黏着斑数量轻微减少和细胞铺展减弱，但PLEKHG3表达未改变这些参数。
**4. 黏着斑作为PLEKHG3与溶酶体汇聚的枢纽**
进一步定量分析显示，Paxillin标记的黏着斑区域中LAMP1和GFP-PLEKHG3的荧光强度显著高于邻近对照区域。活细胞成像观察到LysoTracker标记的溶酶体向GFP-PLEKHG3富集位点移动，并进入正在形成的突起中。
**5. 溶酶体运输影响PLEKHG3定位**
过表达KIF1A（驱动溶酶体外周运输）导致GFP-PLEKHG3和LAMP1显著向细胞外周集中，而RUFY3（促进溶酶体向核周运输）则无此效应。但KIF1A过表达并未增加突起数量，反而显著减少突起形成，且该效应在GFP-PLEKHG3表达细胞中更为显著。定量分析显示，KIF1A使细胞更圆、黏着斑数量增加、面积增大，同时突起活性降低。
**6. 强制溶酶体外周分散降低细胞迁移和膜突起动力学**
活细胞成像证实，KIF1A过表达细胞（无论是否表达GFP-PLEKHG3）均表现出更低的突起形成率、更低的F-肌动蛋白动态性，且细胞形态更圆、长宽比降低。在PLEKHG3 KO细胞中，KIF1A同样抑制突起形成，表明该效应不依赖PLEKHG3。

**结论与讨论**
研究人员通过TurboID邻近标记鉴定出PLEKHG3为LAMTOR3的邻近蛋白，并证实其与溶酶体在黏着斑位点共定位。强制溶酶体外周分散（通过KIF1A）可集中PLEKHG3至质膜，但抑制突起形成和细胞迁移，且该效应在PLEKHG3敲除后仍存在，表明PLEKHG3非必需，而溶酶体定位本身通过调控黏着斑动力学主导突起输出。该研究揭示了溶酶体定位在控制细胞突起活性中的新机制，并为理解溶酶体作为信号平台在细胞运动中的功能提供了新视角。结论部分翻译：溶酶体定位既控制PLEKHG3的定位也控制突起活性，但突起变化可独立于PLEKHG3发生。