鉴定和表征一种对N-连接的吡喃葡萄糖苷具有水解活性的植物GH1 β-葡萄糖苷酶

《FEBS Open Bio》：Identifying and characterising a plant GH1 β-glucosidase that exhibits hydrolytic activity on N-linked glucopyranoside

　　

β-葡萄糖苷酶（Bgls）催化β-D-糖苷键的水解，并广泛用作工业生物催化剂。虽然它们对O-和S-连接的吡喃葡萄糖苷的活性已得到充分证实，但此前尚未证明Bgls对N-连接的吡喃葡萄糖苷的水解。在本研究中，研究人员筛选了一个真核Bgl文库，以检测其对甲基邻氨基苯甲酸酯-N-β-D-吡喃葡萄糖苷（MANT-N-葡萄糖）的活性，这是一种研究人员最近通过生物催化方式生产的新型N-吡喃葡萄糖苷。研究人员鉴定出ZmGlu1能够水解该底物，尽管其催化效率相对于天然O-吡喃葡萄糖苷底物显著降低。酶-底物复合物的结构建模揭示了可能造成这种活性降低的相互作用。这些发现确立了N-吡喃葡萄糖苷作为Bgl底物的地位，并为工程化具有更广泛糖苷键特异性的Bgl奠定了基础。

**论文解读：植物GH1 β-葡萄糖苷酶对N-连接吡喃葡萄糖苷的水解活性鉴定与表征**

**研究背景与意义**

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases, Bgls, E.C. 3.2.1.21）是一类催化糖苷键水解的酶，广泛存在于自然界，在生物质转化、宿主-病原体互作和植物激素激活等过程中发挥关键作用，并因其独特的催化特性被应用于食品生产和生物燃料等工业领域。Bgls隶属于糖苷水解酶（glycoside hydrolases, GHs, E.C. 3.2.1.-）家族，其中GH1家族包含最大比例的Bgls。尽管Bgls对O-连接和S-连接糖苷的水解活性已有充分研究，但此前尚未报道过Bgls能够水解小分子N-连接的吡喃葡萄糖苷。研究人员在前期工作中通过生物催化方式生产了一种新型N-吡喃葡萄糖苷——甲基邻氨基苯甲酸酯-N-β-D-吡喃葡萄糖苷（MANT-N-glucose）。本研究旨在鉴定一种能够水解该产物的GH，从而拓展对Bgl底物谱的认识，并为工程化具有更广泛糖苷键特异性的Bgl奠定基础。该论文发表在《FEBS Open Bio》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用了两条并行策略：（1）将MANT-N-葡萄糖作为碳源，在体外筛选七种人肠道细菌（包括Bacteroides ovatus DSM1896、B. thetaiotaomicron DSM2079、Bifidobacterium longum subsp. longum 1-6B、Blautia hansenii DSM20583、Eubacterium ramulus DSM15684、E. ramulus DSM16296和Roseburia intestinalis DSM14610）的代谢能力，通过监测OD₆₀₀和HPLC分析MANT-N-葡萄糖的转化情况；（2）构建一个真核GH1 Bgl文库（包括来自不同植物的Bgl），利用大肠杆菌表达系统制备细胞裂解液，筛选其对MANT-N-葡萄糖的水解活性。阳性结果经纯化蛋白验证后，进一步通过HPLC测定最适pH、最适温度和动力学参数（Michaelis-Menten曲线），并利用Chai-1预测工具进行酶-底物复合物的结构建模，结合PLIP（protein–ligand interaction profiler）分析分子间相互作用。

**研究结果**

**1. 肠道细菌对MANT-N-葡萄糖的代谢**

研究人员筛选了七种肠道细菌，发现B. ovatus DSM2096和E. ramulus DSM15684在MANT-N-葡萄糖存在下细胞密度增加最显著。进一步分析表明，在36小时内，E. ramulus培养物中MANT-N-葡萄糖的转化与对照组无显著差异（P=0.6294），而B. ovatus则显示出显著增加（P<0.0001），表明细胞密度与MANT-N-葡萄糖转化之间存在关联。但未观察到糖苷的完全消耗，研究人员推测Bacteroides中可能存在一种涉及多种糖苷酶的N-吡喃葡萄糖苷水解机制。

**2. 发现玉米（Zea mays）中一种水解N-吡喃葡萄糖苷的Bgl**

通过筛选Bgl文库，研究人员发现一个含有ZmGlu1的大肠杆菌裂解液在反应后MANT（水解产物）的丰度略有升高。纯化后的ZmGlu1与MANT-N-葡萄糖孵育后，HPLC色谱图显示MANT显著积累，确认了其水解活性。ZmGlu1的天然底物是抗菌化合物DIMBOA的O-糖苷形式，并参与植物生长发育中的细胞分裂素释放。本研究将MANT-N-葡萄糖纳入其底物谱，提示ZmGlu1的功能可能比先前假设的更广泛。鉴于所测试的Bgl文库规模较小，自然界中很可能存在许多其他具有小分子N-吡喃葡萄糖苷水解活性的GH。

**3. Bgl催化MANT-N-葡萄糖水解的特性表征**

研究人员确定了ZmGlu1催化MANT-N-葡萄糖水解的最适条件：在磷酸缓冲液中pH 6.0时活性最高，这与先前对ZmGlu1的报道一致，说明催化残基的质子化状态对两种底物的水解均至关重要，支持共有的反应机制。最适反应温度确定为35°C（1小时反应），与先前报道的50°C存在差异，这可能归因于酶在35°C以上稳定性降低，而低反应速率需延长孵育时间导致了这一差异。动力学参数测定显示，与ZmGlu1对DIMBOA-葡萄糖苷（K_m=0.098 mM, k_cat=29 s^-1）和人工底物4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷（K_m=0.38 mM, k_cat=24 s^-1）相比，对MANT-N-葡萄糖的水解速率明显更慢，且需要更高底物浓度才能达到饱和。

**4. ZmGlu1:MANT-N-葡萄糖复合物的结构建模**

利用Chai-1预测工具生成的复合物结构模型显示，MANT-N-葡萄糖在所有五个输出结构中均以相同取向结合。与ZmGlu1结合DIMBOA-葡萄糖苷的晶体结构（PDB: 1E56）比较，结合坐标高度吻合，且异头碳和N-糖苷键邻近两个催化谷氨酸残基（E191和E406），表明这些残基可能在N-糖苷水解中起核心作用。通过比较两种复合物结构，研究人员推测动力学差异的原因：MANT-N-葡萄糖的苷元部分比DIMBOA-葡萄糖苷更深地嵌入活性口袋，Y333和W378可能介导分子间相互作用，但MANT-N-葡萄糖的苯环位于ZmGlu1的极性区域，可能产生不利的静电相互作用。此外，DIMBOA-葡萄糖苷结合位点中的水分子在MANT-N-葡萄糖结合时被置换，可能导致焓/熵惩罚，除非有稳定相互作用补偿。

**讨论与结论**

研究人员首次报道了能够催化N-吡喃葡萄糖苷（MANT-N-葡萄糖）水解的Bgl（ZmGlu1），并对其反应进行了表征，通过结构模型讨论了其与天然反应相比独特的动力学特性。研究结论指出，这些发现确立了N-吡喃葡萄糖苷作为Bgl底物的地位，并鼓励进一步研究Bgl催化的N-糖苷水解，以促进机制理解并支持鉴定更多Bgl的N-连接底物。