PKA介导的蛋白酶体激活在收缩期负荷期间保护心脏免受重塑和心力衰竭

《The FASEB Journal》：PKA-Mediated Proteasome Activation Protects Against Cardiac Remodeling and Heart Failure During Systolic Overload

　　

由慢性收缩期负荷导致的心力衰竭（HF）与蛋白稳态负担增加和蛋白酶体功能受损相关。蛋白酶体亚基RPN6/PSMD11在Ser14位点的磷酸化（pS14-RPN6）介导了PKA对26S蛋白酶体的激活，但这一机制在常见心脏病中的意义仍不明确。因此，研究人员研究了pS14-RPN6的遗传阻断对收缩期负荷（高血压和主动脉瓣狭窄中常见的状况）期间心脏重塑和心力衰竭的影响。研究人员在非缺血性心力衰竭（NI-HF）患者的心肌组织中检测到泛素（Ub）结合物显著增加，同时RPN6和pS14-RPN6蛋白水平升高。类似地，在野生型小鼠横向主动脉缩窄（TAC）后2周和4周，心肌pS14-Rpn6水平增加。与野生型同窝对照相比，因种系敲入Rpn6^S14A（S14A小鼠）而遗传阻断pS14-Rpn6的小鼠，在TAC后表现出更严重的心脏肥大、纤维化、左心室功能障碍和肺充血。机制上，TAC在2周时诱导了两种基因型小鼠中26S和30S蛋白酶体的可比性增加，但在TAC后4周，S14A小鼠中这些增加显著减弱。同时，S14A小鼠中TAC诱导的蛋白酶体肽酶活性增加显著减弱（2周）或完全消失（4周），并伴有总泛素和K48连接泛素结合物的更大增加。总之，这些发现表明pS14-RPN6在上调心肌蛋白酶体活性和持续上调蛋白酶体组装中发挥关键作用，从而有助于维持蛋白稳态，并在收缩期负荷期间防止不适应的心脏重塑和心力衰竭。

**论文解读文章**

**研究背景**
心力衰竭（HF）是多种心血管疾病的终末阶段，慢性收缩期负荷（如高血压和主动脉瓣狭窄）是其主要诱因。收缩期负荷导致心脏蛋白合成增加，包括错误折叠蛋白和天然蛋白，这加剧了蛋白稳态（proteostasis）负担。泛素-蛋白酶体系统（UPS）是细胞内主要的蛋白降解途径，负责选择性降解错误折叠蛋白和调节蛋白。然而，在收缩期负荷下，蛋白酶体功能常出现不足（proteasome functional insufficiency，PFI），导致有毒蛋白积累，促进心脏重塑和心力衰竭。以往研究在培养细胞中证实，cAMP依赖的蛋白激酶（PKA）通过磷酸化蛋白酶体亚基RPN6（PSMD11）的Ser14位点（pS14-RPN6）激活26S蛋白酶体，但该机制在常见心脏病（如收缩期负荷引起的心力衰竭）中的病理生理意义尚不明确。因此，研究人员利用Rpn6^S14A（S14A）敲入小鼠模型，直接验证pS14-RPN6在收缩期负荷诱导的心脏重塑和心力衰竭中的作用。该研究发表在《The FASEB Journal》。

**研究内容与结论**
研究人员发现，pS14-RPN6在收缩期负荷下上调心肌蛋白酶体活性，维持蛋白稳态，保护心脏免受不适应重塑和心力衰竭。具体结论包括：在人类非缺血性心力衰竭（NI-HF）心肌中，pS14-RPN6和泛素（Ub）结合物增加；在小鼠中，pS14-RPN6的遗传阻断（S14A）加重了横向主动脉缩窄（TAC）诱导的心脏肥大、纤维化、左心室功能障碍和肺充血，并削弱了蛋白酶体活性和组装。该研究首次在病理条件下证明了pS14-RPN6对于维持蛋白稳态和心脏适应性的必要性，并提示其作为收缩期负荷致心力衰竭治疗靶点的潜力。

**主要关键技术方法**
研究人员使用了人类心肌组织样本（来自非缺血性心力衰竭患者和脑死亡供体，经明尼苏达大学和德克萨斯大学健康科学中心机构审查委员会批准）和Rpn6^S14A敲入小鼠（C57BL/6J背景，经南达科他大学动物护理和使用委员会批准）。关键技术包括：横向主动脉缩窄（TAC）手术建立小鼠收缩期负荷模型；超声心动图（Vevo 3100）评估心脏结构和功能；组织学染色（小麦胚芽凝集素（WGA）测定心肌细胞横截面积，天狼星红染色评估纤维化）；蛋白质印迹（Western blot）检测pS14-Rpn6和泛素结合物；天然凝胶电泳及凝胶内蛋白酶体活性测定评估蛋白酶体组装和活性；成年小鼠心肌细胞分离及体外蛋白酶体活性测定。

**研究结果**

**3.1 人类非缺血性心衰中心肌pS14-RPN6和泛素结合物显著增加**
通过蛋白质印迹分析，研究人员发现非缺血性心力衰竭（NI-HF）患者心肌中总RPN6和pS14-RPN6蛋白水平显著升高，但pS14-RPN6与总RPN6的比例未变。同时，总泛素和K48连接泛素结合物（K48-Ub）也显著增加，提示蛋白酶体功能不足（PFI）的同时，pS14-RPN6代偿性上调。

**3.2 收缩期负荷小鼠心肌pS14-Rpn6上调**
野生型（WT）小鼠在横向主动脉缩窄（TAC）后2周和4周，心肌pS14-Rpn6水平显著升高，而S14A敲入小鼠中pS14-Rpn6不可检测，且总Rpn6蛋白水平不变，表明TAC诱导的pS14-Rpn6增加源于磷酸化增强而非蛋白表达改变。

**3.3 遗传阻断pS14-Rpn6加剧TAC后急性心脏反应**
在TAC后1周，S14A小鼠左心室后壁厚度（LVPW;d）和心脏重量/胫骨长度（HW/TL）比值较WT小鼠显著增加，同时胎儿基因Nppa和Nppb表达更高，但心脏收缩功能（射血分数、心输出量）和纤维化标志物无显著差异，表明pS14-Rpn6缺失在早期加剧肥大反应。

**3.4 遗传阻断pS14-Rpn6加剧TAC后慢性心脏重塑和心力衰竭**
在TAC后12周，通过连续超声心动图、组织学和重量分析，研究人员发现S14A小鼠左心室后壁厚度更厚、左心室舒张末期容积（EDV）更大、射血分数（EF）更低、心输出量（CO）更小，且肺充血指数（肺重量/胫骨长度）更高。组织学显示S14A小鼠心肌细胞横截面积（CSA）更大，胶原沉积和胶原1 mRNA表达更显著，表明pS14-Rpn6缺失加速了病理重塑和心力衰竭进展。

**3.5 TAC诱导的蛋白酶体活性增加在S14A小鼠中减弱**
通过天然凝胶电泳，研究人员发现TAC后2周和4周，WT小鼠心肌中单帽（SC；26S）和双帽（DC；30S）蛋白酶体的糜蛋白酶样活性增加，而S14A小鼠中这些增加在2周时显著减弱，4周时完全消失。同时，S14A小鼠中TAC诱导的蛋白酶体组装（Rpt2阳性蛋白水平）增加在4周时显著低于WT小鼠，表明pS14-Rpn6对维持慢性期蛋白酶体组装至关重要。

**3.6 遗传阻断pS14-RPN6加剧TAC诱导的蛋白稳态损伤**
蛋白质印迹分析显示，TAC后2周和4周，WT小鼠心肌中总泛素和K48连接泛素结合物增加，而S14A小鼠中这些增加更为显著，表明pS14-Rpn6缺失导致泛素化蛋白清除能力下降，加剧蛋白毒性。

**3.7 S14A导致的心肌蛋白酶体激活和蛋白稳态损伤是心肌细胞自主的**
从TAC后2周小鼠分离的心肌细胞中，研究人员发现S14A心肌细胞中ATP依赖性蛋白酶体糜蛋白酶样活性增加显著低于WT，而总泛素和K48连接泛素结合物增加更显著，证明pS14-Rpn6在心肌细胞内发挥直接作用。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，pS14-RPN6在收缩期负荷下通过上调蛋白酶体活性和维持组装，补偿蛋白降解需求，保护心脏。在人类非缺血性心力衰竭中，pS14-RPN6代偿性增加但不足以满足需求，提示增强pS14-RPN6可能是潜在治疗策略。研究结论翻译为：这些发现表明，pS14-RPN6在收缩期负荷期间上调心肌蛋白酶体活性并持续上调蛋白酶体组装中发挥关键作用，从而有助于维持蛋白稳态，并防止不适应的心脏重塑和心力衰竭。