DNA低甲基化对多梳抑制复合物2缺陷型恶性外周神经鞘瘤并非细胞内在毒性

《Genes, Chromosomes and Cancer》：DNA Hypomethylation Is Not Cell Intrinsically Toxic to Polycomb Repressive Complex 2 Deficient Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors

　　

恶性外周神经鞘瘤（MPNST）是侵袭性软组织肉瘤，也是神经纤维瘤病1型（NF1）患者疾病相关死亡的最常见原因。在NF1背景下，MPNST由良性癌前病变发展而来，向恶性肿瘤的转变通常伴随多梳抑制复合物2（PRC2）的缺失，由于组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）的全局耗竭，导致超过1200个基因异常上调。既往研究表明，细胞可能通过基因组高甲基化来补偿这种抑制性组蛋白标记的缺失。在此，研究人员分析了MPNST细胞系以及同基因PRC2缺陷型和PRC2健全型CRISPR工程化永生化人施万细胞中的全基因组DNA甲基化和转录组。除PRC2状态的影响外，研究人员还测定了两种DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTi）——地西他滨和阿扎胞苷的作用。研究发现PRC2状态并不影响全局DNA甲基化或特定基因组特征的平均甲基化水平。此外，地西他滨和阿扎胞苷对MPNST具有差异效应。虽然两种DNMTi均使基因组低甲基化，但它们上调不同的靶标。阿扎胞苷上调参与RNA加工通路的基因并表现出直接的肿瘤细胞毒性，而地西他滨上调参与免疫应答的基因，无直接细胞杀伤作用，并可能通过改变肿瘤微环境在体内抑制肿瘤生长。研究显示，无论PRC2状态如何，单独的DNA低甲基化不足以杀死MPNST细胞。因此，这些发现提示DNMT抑制剂应与其他靶向疗法联合用于MPNST患者。

**论文解读：DNA低甲基化对PRC2缺陷型恶性外周神经鞘瘤并非细胞内在毒性**

**一、研究背景与问题**

恶性外周神经鞘瘤（MPNST）是起源于施万细胞谱系的侵袭性软组织肉瘤，在普通人群中罕见，但却是神经纤维瘤病1型（NF1）患者疾病相关死亡的首要原因。NF1是一种癌症易感综合征，由NF1基因单拷贝功能缺失突变遗传所致，该基因编码神经纤维蛋白（neurofibromin），一种RAS GTP酶激活蛋白（GAP）。NF1患者易患多种良恶性肿瘤，MPNST通过一条特征明确的遗传途径发生：首先NF1剩余野生型等位基因缺失，导致NF1双等位基因失活，联合肿瘤微环境改变，发展为丛状神经纤维瘤（PN）；随后CDKN2A功能缺失突变或缺失（常伴随CDKN2B缺失）导致非典型神经纤维瘤样肿瘤（ANNUBP）形成；最终在约80%病例中发生SUZ12或EED双等位基因功能缺失突变，驱动MPNST发生。SUZ12和EED蛋白产物构成多梳抑制复合物2（PRC2）的核心组分，催化组蛋白H3第27位赖氨酸的单、二、三甲基化，沉默基因表达以维持细胞身份。PRC2失活的MPNST几乎完全丧失H3K27me3，并伴随H3K27ac增加，导致超过1200个基因异常异位表达。

关于PRC2缺失与DNA甲基化在MPNST中的关系一直存在争议。部分研究报道PRC2缺陷型MPNST存在轻度低甲基化或全局DNA甲基化无变化，而另一些研究显示PRC2缺失诱导全基因组高甲基化，可能是对PRC2介导的抑制缺失的补偿反应。这一“补偿性高甲基化”假说认为PRC2缺陷细胞变得独特依赖DNA甲基转移酶（DNMT）维持基因沉默，从而产生可利用DNMT抑制剂（DNMTi）的治疗脆弱性。已有报道称DNMTi可诱导PRC2缺陷MPNST细胞产生病毒模拟效应，通过激活内源性逆转录病毒形成双链RNA触发干扰素应答，导致细胞死亡。目前，地西他滨（decitabine）和阿扎胞苷（azacitidine）两种DNMTi已被FDA批准用于急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征治疗。地西他滨在细胞内转化为活性三磷酸形式掺入DNA，不可逆结合DNMT，阻止复制期间DNA甲基化；而阿扎胞苷仅约15%代谢为同一DNA掺入三磷酸形式发挥DNMTi功能，其余大部分转化为核糖三磷酸掺入RNA，干扰RNA加工和蛋白质合成。地西他滨正在PRC2缺陷MPNST患者中进行II期临床试验（NCT04872543），因此评估DNMTi在MPNST中的疗效及PRC2状态作为敏感性生物标志物的潜力至关重要。

**二、研究内容与结论**

研究人员首先利用Nanopore基因组扫描（genome skimming）技术建立了细胞系panel的基线全局DNA甲基化水平。基因组扫描是一种低深度测序方法，通常用于进化研究中分析高拷贝区域（如核糖体DNA和线粒体基因组），近期因Nanopore直接测序5mC的特性而用于计算全基因组和重复元件家族的甲基化分数。随后评估了两种抑制剂在体外诱导细胞死亡和凋亡的效力及在体内异种移植模型中的肿瘤控制效果。为阐明潜在机制，研究人员量化了DNMTi诱导的低甲基化、基因表达变化，并鉴定了差异调控通路。研究结果表明：PRC2状态不显著改变MPNST细胞中基线全局DNA甲基化水平或特定基因组特征的平均甲基化；地西他滨和阿扎胞苷虽均有效降低DNA甲基化，但通过不同但重叠的分子机制调控不同的基因集；DNMTi诱导的DNA低甲基化本身对MPNST细胞无内在毒性，PRC2缺陷并不使这些肿瘤对全局甲基化丢失敏感化。

**三、主要技术方法**

本研究涉及的关键技术方法包括：①Nanopore基因组扫描（genome skimming）用于测量全基因组及基因组特征（转录起始位点TSS、CpG岛CGI、Alu元件、LINE1元件、人内源性逆转录病毒hERV）的甲基化分数；②RNA测序（RNA-Seq）结合DESeq2进行差异基因表达分析，GSEA进行通路富集分析，TEtranscripts分析重复元件表达；③体外药物敏感性测试（alamarBlue活力测定）评估IC50；④体内异种移植实验（NRG免疫缺陷小鼠，皮下接种S462TY细胞）评估肿瘤生长；⑤流式细胞术检测细胞凋亡（Caspase-3/-7和Annexin V染色）；⑥免疫组化（IHC）检测肿瘤组织中CD11b、F4/80、CD31表达以评估免疫细胞浸润和血管生成。样本队列来源包括：MPNST细胞系S462TY、ST88-3、ST88-14、STS26T、MPNST-724、NF90.8（由Nancy Ratner博士提供）、JH-2-002 CL（Christine Pratilas博士提供）、MPNST-642（MD Anderson癌症中心特征化细胞系核心设施）、sNF96.2（ATCC购买）；永生化人施万细胞（iHSCs）由研究人员实验室构建；SUZ12回补细胞系S462TY-500-5、JH-2-002 CL和ST88-14（后者由Jack Shern博士提供）用于恢复PRC2功能。

**四、研究结果**

**3.1 全局DNA甲基化水平并非PRC2状态的指示指标**

通过基因组扫描测量PRC2缺陷型和PRC2健全型MPNST细胞系、iHSCs及回补细胞系的全局DNA甲基化分数。结果显示：MPNST细胞系中PRC2健全型（0.56±0.10，n=2）与PRC2缺陷型（0.71±0.06，n=7）无显著差异（p=0.335）；同基因iHSCs中PRC2健全型（0.57±0.02，n=2）与缺陷型（0.61±0.02，n=4）亦无显著差异（p=0.343）；回补细胞系中PRC2健全型（0.72±0.08，n=2）与缺陷型（0.73±0.08，n=2）几乎相同（p=0.996）。进一步分析iHSCs中TSS、CGI、Alu元件、LINE1元件和hERV的平均甲基化水平，均未发现PRC2状态相关的显著变化。这表明PRC2状态不影响全局DNA甲基化或特定基因组特征的平均甲基化水平。

**3.2 地西他滨诱导的DNA低甲基化对MPNST无内在毒性，与PRC2状态无关**

体外实验显示，地西他滨在高达1000 μM浓度下不杀死MPNST细胞系，而阿扎胞苷有效杀死MPNST细胞系，平均IC50为12.5 μM。仅阿扎胞苷诱导MPNST细胞凋亡。Nanopore基因组扫描证实两种DNMTi均显著降低全局DNA甲基化。尽管两者均显著减少DNA甲基化，但只有阿扎胞苷诱导凋亡，表明低甲基化本身不足以解释治疗疗效。体内异种移植实验中，阿扎胞苷（p=0.003）和地西他滨（p=0.01）均显著减缓肿瘤生长。免疫组化分析显示，地西他滨治疗肿瘤中F4/80（巨噬细胞标记）和CD31（血管生成标记）显著降低，而阿扎胞苷治疗肿瘤中无显著变化。这提示地西他滨的体内抗肿瘤作用可能通过改变肿瘤微环境（减少巨噬细胞浸润和血管生成）而非直接杀伤肿瘤细胞实现。

**3.3 阿扎胞苷和地西他滨对基因表达具有差异效应**

RNA-Seq通路分析显示，与地西他滨相比，阿扎胞苷上调的前五大基因本体生物学过程均涉及RNA加工；而地西他滨比阿扎胞苷更强效上调免疫应答相关基因。转座元件（TE）表达分析显示，地西他滨去抑制的TE家族范围比阿扎胞苷更广，长末端重复（LTR）逆转录元件是两种处理中最显著上调的家族。地西他滨诱导的特定基因和TE富集于免疫相关通路，这为地西他滨虽无体外细胞毒性但能控制体内肿瘤生长提供了机制基础，可能通过刺激非T细胞依赖性免疫应答实现。

**五、讨论与结论**

本研究结果与Wojcik等人（2019）及Patel等人（2023）的报道不同，研究人员在多种同基因人类MPNST和永生化施万细胞系统中均未观察到PRC2状态对全局DNA甲基化或地西他滨敏感性的影响。使用严格对照的同基因系统最大程度减少了混杂遗传背景效应，增强了对“PRC2缺失单独不足以改变甲基化或赋予地西他滨敏感性”这一结论的信心。研究人员推测地西他滨减缓肿瘤生长可能通过影响血管生成和免疫细胞浸润实现，而非直接作用于肿瘤细胞。地西他滨显著降低CD31和F4/80，与既往报道一致（地西他滨通过减少血管生成性VEGF变异体并增加抗血管生成变异体来抑制血管生成）。巨噬细胞减少可能反映了肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的减少，而TAM在包括MPNST在内的多种癌症中促进肿瘤发展和进展。此外，地西他滨上调更广泛的TE家族，可能促进病毒模拟效应并刺激免疫激活，尽管NRG小鼠缺乏T和NK细胞，无法测试适应性免疫应答，但在免疫健全模型中可能产生更强的病毒模拟诱导的免疫应答。

最终结论：研究数据凸显了两种去甲基化药物在MPNST中的不同治疗谱。地西他滨可能通过改变肿瘤微环境抑制体内肿瘤生长，而阿扎胞苷在体外表现出优越的直接肿瘤细胞毒性。鉴于其强大的直接杀伤能力，阿扎胞苷仍是极具前景的临床候选药物，但需在免疫健全模型中进行进一步体内研究以确立其治疗优越性。值得注意的是，两种药物的效应似乎并非特异于PRC2缺陷肿瘤。研究人员未发现与PRC2状态相关的全局DNA甲基化显著差异，也未观察到基因组特征平均甲基化的显著差异。最终，该研究强调基因组低甲基化本身不足以诱导MPNST细胞死亡，提示DNMT抑制剂应与其它靶向疗法联合应用于MPNST患者。