鼠李糖乳杆菌与嗜酸乳杆菌在人树突状细胞中的免疫调节作用

《Archives of Microbiology》：Immunomodulatory effect of Lacticaseibacillus rhamnosus and Lactobacillus acidophilus in human dendritic cells

　　

本研究探讨了益生菌菌株鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）LR-32与嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）LA-5的免疫调节特性，通过评估其对人树突状细胞（dendritic cell，DC）应答的影响。研究人员从人CD14+单核细胞获得未成熟DC，并以DC:细菌为1:10的比例用大肠杆菌（Escherichia coli）脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和/或益生菌乳杆菌进行刺激。通过RT-qPCR评估炎症介质与模式识别受体的相对转录水平。细胞因子产生与表面标志物表达分别通过ELISA与流式细胞术评价。DC功能进一步在其与CD4+ T淋巴细胞互作后评估，随后通过流式细胞术分析T细胞表型、ELISA分析细胞因子产生。与未成熟DC相比，LPS上调了胞内受体AIM2、NOD1与NOD2的转录，并增加了COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL-8、IL-12与IL-18 mRNA水平（p?<?0.001）。与LPS刺激的DC相比，益生菌暴露下调了大多数编码受体与炎症介质的基因的转录。在LPS刺激的DC中，LA-5降低了胞内与胞外受体基因表达，增加了COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL-8与IL-10转录，并降低IL-12 mRNA水平。LR-32上调TLR2、COX-2、IL-6、CXCL-8与IL-10，同时降低IL-12表达，尽管这些效应弱于LA-5所诱导者。LA-5暴露的DC比LR-32诱导了更高频率的CD25highFOXP3highCD127low CD4+ T细胞。这些发现表明LA-5与LR-32以菌株依赖方式调节人DC应答。这些益生菌并非作为广泛抗炎刺激物，而是通过调节模式识别受体通路、细胞因子应答及Treg关联的CD4+ T细胞表型，重塑LPS诱导的活化，提示其在受控黏膜免疫调节中的潜在作用。

研究背景方面，牙周炎是一种与口腔微生物群失调及宿主免疫应答失衡相关的慢性炎症性疾病，组织破坏不仅由微生物挑战决定，也受宿主调控炎症程度与持续性的机制影响。先天免疫系统是抵御牙周微生物的第一道防线，其中树突状细胞（dendritic cell，DC）作为专业抗原提呈细胞，在黏膜免疫监视中居核心地位，通过模式识别受体（pattern-recognition receptor，PRR）包括Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）、NOD样受体（NOD-like receptor，NLR）及炎症小体相关感受器识别微生物相关分子模式，进而调控共刺激分子与炎症介质表达，影响T细胞极化与保护性免疫、慢性炎症及免疫耐受间的平衡。益生菌因可干扰病原微生物、调节生物膜生态、增强上皮屏障及调控宿主免疫，成为控制牙周炎症的潜在辅助手段，但益生菌效应高度菌株依赖。研究人员选择嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）LA-5与鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）LR-32，系因既往研究提示其可干扰牙周病原体、降低牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）在上皮细胞粘附侵袭及在多物种生物膜中丰度。本研究假设两菌株以菌株依赖方式调节人单核细胞来源DC应答，尤其在LPS诱导炎症刺激下，旨在明确其如何重塑DC应答，为牙周免疫调节提供机制线索。论文发表于《Archives of Microbiology》。

关键技术方法上，研究人员从8名健康供体（均值年龄35±5岁，6女2男）外周血经密度梯度离心获单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），冻存混池后取 aliquot 经磁珠分选CD14⁺单核细胞，以GM-CSF与IL-4诱导7天生成未成熟DC；以DC:细菌1:10比例用E. coli O111:B4 LPS（1 μg/mL）及/或标准化至约2.0×10⁸ CFU/mL的益生菌共培养24小时；通过RT-qPCR（ΔΔCt法，GAPDH内参）定量PRR及炎症介质转录，ELISA测上清细胞因子，流式细胞术分析DC表面CD80/CD86/CD1a及T细胞CD25^highFOXP3^highCD127^low表型；并将处理过的DC与同源初始CD4⁺CD45RA⁺ T细胞以1:10共培养12天，评估Treg关联表型与可溶性细胞因子谱。

研究结果部分，各小节结论如下。树突状细胞活力：LPS或益生菌暴露均较未处理组降低DC活力（p<0.05），但各刺激组间无显著差异，故菌株特异性效应非由细胞毒性差异所致。益生菌调节未成熟及LPS刺激DC中模式识别受体基因表达：LPS普遍下调多数受体基因而上调NOD1；两菌株单独暴露亦抑受体转录，LR-32对NLRP3/NOD1/TLR2/TLR4抑制更强（p<0.001）；LPS共刺激下两菌整体下调NLRP3/NOD1/NOD2/TLR4/AIM2，但LR-32在LPS背景下特异上调TLR2，显示菌株与DC活化状态共同决定PRR调制。益生菌差异调节炎症与调节性细胞因子基因表达：LPS强烈上调COX-2/TNF-α/IL-1β/IL-6/CXCL-8/IL-12/IL-18（p<0.001）；单菌暴露炎症转录弱于LPS，LA-5单菌上调CXCL-8；LPS共刺激时LA-5进一步抬高TNF-α/IL-1β/IL-6转录并升IL-10、降IL-12/IL-18至中间水平，LR-32对COX-2/CXCL-8抑制相对更明显，证明两菌重定向而非单纯抑制LPS炎症程序。LPS与益生菌刺激后细胞因子分泌：ELISA示LPS显增TNF-α/IL-6/CXCL-8（p<0.05）；LA-5共刺激不改变TNF-α/IL-6相较LPSalone，但两菌均显著降低CXCL-8分泌（p<0.05），表明转录-蛋白间存部分解偶联，选择性衰减CXCL-8为主。流式提示DC部分活化/成熟：两菌升CD80/CD86、降CD1a，幅度似LPS但CD86更一致，归为共刺激表型调制而非完全成熟。益生菌暴露DC调节CD4⁺ T细胞Treg关联表型：LA-5处理DC诱导CD25^highFOXP3^highCD127^low CD4⁺ T细胞频率高于LR-32，且可比LPS处理DC；共培养上清中LA-5组TNF-α低于LPS组、IL-1β高于LPS组、CXCL-8最高，证实菌株依赖的可溶性炎症环境重塑。

讨论与结论翻译部分，研究人员指出LA-5与LR-32以菌株依赖方式调制人单核细胞来源DC：非广义抗炎物，而是重塑PRR基因表达、细胞因子转录与分泌、共刺激分子及Treg关联CD4⁺ T细胞诱导能力。LR-32对多种PRR基因抑制更强；LA-5则呈现混合活化谱——选择性炎症介质表达、LPS下升IL-10转录、调共刺激标志、更强促Treg关联表型。活力下降在各刺激组均一，非菌株效应对因。LPS下NOD1维持上调反映胞内受体参与炎症放大；TLR转录下调伴炎症介质上调符合配体 Engagement 后反馈衰减。DC:细菌1:10为简化体外比，不等于牙周生物膜密度与多微生物复杂度。转录-蛋白部分解偶联源于转录后调控与动力学差。LA-5所诱炎因子转录与Treg表型并存，说明DC可处混合活化态，整体信号整合而非单因子决定。结论为：LA-5与LR-32菌株依赖地调制人DC应答；LR-32偏抑PRR转录，LA-5促混合活化并更强诱导Treg关联CD4⁺ T细胞，二者重塑而非抑制DC活化，对黏膜免疫调节具潜在意义，但需以牙周病原体LPS、全菌或多物种生物膜及功能性Treg抑制实验进一步验证。