综述：土壤N2O研究三十年——见解与空白

《Global Change Biology》：Three Decades of Soil N2O Research—Insights and Gaps

　　

一氧化二氮（N₂O）是一种强效温室气体（GHG），其大气浓度持续上升，主要由农业土壤的氮（N）输入驱动。在过去的三十年里，土壤N₂O排放研究取得了显著进展，但关键不确定性仍制约着减缓努力。在此，研究人员综合了从1990年代至今在测量技术、过程理解、微生物生态学和建模方面的发展，并识别了未来研究的关键空白。高频测量、激光光谱学和同位素方法的进展揭示了时间“热点时刻”和空间“热点区域”的重要性，挑战了基于稀疏采样的早期假设。同时，分子和多组学工具转变了研究人员对N₂O生产和消耗的微生物驱动因素的理解，强调了群落组成、截断途径以及先前被忽视的N₂O生产和还原生物的作用。基于过程的模型已从研究工具发展为支撑温室气体清单的政策相关框架，并整合了数据同化、集合模型和人工智能。然而，尽管取得了这些进展，在连接尺度、减少不确定性以及将机制见解转化为可扩展的减缓策略方面仍存在持续挑战。填补这些空白提供了一个独特的机会，将数十年的科学进展转化为下一代减缓策略，使农业生产力与气候稳定目标相协调。

**1 引言**
一氧化二氮（N₂O）是一种重要的大气温室气体（GHG），对观测到的全球变暖贡献约6%。其大气浓度从工业化前的约280 ppbv升至2025年的约440 ppbv，且自1985年以来增长率持续增加，近年超过1 ppbv/年。N₂O的全球增温潜势约为CO₂的300倍，大气寿命114年，其持续上升对实现气候目标构成严峻挑战。主要驱动因素是有机氮肥和合成氮肥的使用。农业源（尤其是施肥土壤）占2020年全球人为排放的60%以上，自1980年以来增加了约65%。亟需在不危及粮食生产的前提下减少农业N₂O排放，但测量、过程理解和建模方面的局限与不确定性阻碍了减缓方案的识别。本综述总结了自1990年代以来农业土壤N₂O排放研究的发展，并指出前进方向，以解决研究空白并识别在环境变化条件下减少农业N₂O足迹的具体减缓方案。

**2 土壤一氧化二氮测量的进展**
1990年代的农业土壤N₂O排放研究主要依赖手动、低频的采样方案，通常仅覆盖作物生长期。标准流程为注射器收集气体样品，储存数周后在实验室用气相色谱法分析。由于灵敏度较低（约1-2 ppbv），箱体关闭时间需30-60分钟，通量检测限为3-5 μg N₂O-N·m^-2·h^-1。采样频率多为双周或每月，且常忽略非生长季，导致低估年排放并增加不确定性。20世纪末至21世纪初，越来越多研究表明冻融和土壤重新湿润期会触发显著的N₂O脉冲排放，这些事件对年排放贡献不成比例。此外，空间热点（如残留物团块）也被发现是理解N₂O通量大小的重要因素。这些发现推动自动化测量系统更广泛应用，并建议提高采样频率，但自动化箱体因成本高、供应商有限、现场操作困难而仍不普遍。激光光谱技术（特别是量子级联激光器QCL和光腔衰荡光谱CRDS）的发展使高精度、连续、快速测量成为可能，检测限低于1 ppb。此后，研究人员开始用微气象方法（如涡度相关EC和通量梯度）测量土壤N₂O通量。但设备成本高阻碍了广泛应用。微气象方法需要平坦均匀的地形和数百米侧向跨度，难以研究景观热点。激光光谱仪正变得更小、更坚固、更轻便、更经济，微气象通量测量和软件方案也日益易用。便携式仪器的发展使现场快速箱法得以探索景观尺度的空间通量变异性。此外，QCL或CRDS测量的大气N₂O浓度是高塔测量的标准，支持区域到国家尺度的自上而下估算，并验证改善自下而上的清单估算。随着QCL和同位素比质谱仪（IRMS）的灵敏度和鲁棒性提高，高精度原位N₂O同位素异构体信号测量成为可能。N₂O同位素异构体在其不对称线性分子结构中存在不同的N（¹⁴N和¹⁵N）和O（¹⁶O和¹⁸O）同位素组成，提供独特“指纹”以判断N₂O生产和消耗过程（如细菌和真菌反硝化、硝化）并量化N₂O还原为N₂的程度。目前测量可能需要低温聚焦和预浓缩，但灵敏度快速提升将实现实时原位测量。校准气体的有限可用性仍是障碍之一。

**3 过程研究与基础过程理解**
**3.1 通过硝化和反硝化驱动N₂O排放的因素**
1990年代，研究人员利用IRMS进展探索土壤中N₂O生产和消耗的途径。主要生物过程是硝化和反硝化。研究重点区分硝化菌反硝化、同步硝化-反硝化与经典反硝化。通过添加富集¹⁵NH₄⁺示踪剂测定硝化产生的¹⁵N₂O比例，添加标记¹⁵NO₃^-量化经典反硝化速率。研究人员开始使用低浓度乙炔抑制氨单加氧酶以区分硝化来源的N₂O。研究显示，肥料使用、土壤水分含量和动物粪便施用等因素影响硝化与反硝化作为N₂O来源的相对重要性。但同位素示踪技术可能产生假象：铵示踪剂添加可能刺激硝化，硝酸盐添加可能增加反硝化；乙炔抑制技术并非对所有硝化菌均匀作用，在湿润土壤中扩散不佳，且可能被代谢。因此，在硝化和反硝化之间分配N₂O排放仍具挑战。

**3.2 总N₂O生产和N₂:N₂O比率测量**
1980年代中期开发了气流土壤核心法，用于实验室测量反硝化，可严格控制顶空气体组成、湿度、温度和氧化还原条件，并通过用惰性气体（如氦气）替换土壤N₂来测量N₂O和N₂通量以近似总反硝化速率。但该方法改变了土壤气体组成，不一定代表田间条件。2010年代初，基于¹⁵N池稀释法开发了N₂O池稀释法，使用同位素标记的¹⁵N₂O结合保守示踪剂（如六氟化硫SF₆）同时估算¹⁴N₂O生产、N₂O消耗和泄漏。该方法对N₂O生产的刺激较小，但标记物扩散受限可能导致N₂O消耗低估。估算总生产可近似N₂O产率（反硝化产生的N₂O相对于N₂的比例）。该方法已在实验室和田间应用，提供了新见解，但无法直接捕获NO₃^-胞内直接还原为N₂的过程。量化N₂O产率有助于管理减排，但N₂测量受高背景大气浓度（约78.1%）影响。N₂通量的同位素示踪需要大量¹⁵NO₃^-，仅适用于高施肥系统。高浓度乙炔可抑制N₂O还原酶，用于估算总反硝化，但存在同样缺陷。N₂与氩气（Ar）比率法在海洋系统中广泛使用，但土壤中准确量化受温度、水分和传输的分馏效应影响，导致检测限高。增强型拉曼气体光谱法（Raman gas spectroscopy）可灵敏选择性检测N₂和N₂O并区分同位素，但尚限于实验室。

**4 N₂O的微生物生态学**
**4.1 早期基于培养的N₂O生产微生物见解**
1990年代初，已认识到反硝化菌、氨氧化菌（硝化菌）和硝酸盐氨化菌（DNRA）能在特定条件下产生N₂O，但对不同类群的理解差异大。当时仅鉴定出氨氧化细菌（AOB），研究几乎集中于*Nitrosomonas europaea*。硝化关键酶（氨单加氧酶AMO、羟胺氧化还原酶HAO、亚硝酸盐氧化还原酶NXR）在1990年代被逐步表征。DNRA主要描述于肠道和发酵细菌，但生态作用仍不明确。反硝化菌的系统发育多样性已知重要，已在多种细菌、古菌和真菌中记录。反硝化分离株的表征显示巨大生理差异，尤其在N₂O还原为N₂的能力上，提示微生物群落组成可能影响N₂O通量。催化反硝化四个步骤的主要还原酶（NAR、铜型和cd₁型亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶NIR、一氧化二氮还原酶NOS）已纯化十余年，反硝化基因已从少数细菌菌株（主要是变形菌门）中测序。

**4.2 分子微生物生态学的兴起**
1990年代末，N₂O排放相关微生物生态研究从基于培养转向分子、非培养方法。这一转变由认识到仅约1%的微生物可培养所驱动。环境DNA提取结合功能基因标记（针对硝化、DNRA和反硝化关键步骤）的发展，绕过了培养偏差，可评估环境中参与N₂O生产和消耗的微生物多样性。这些工具迅速被实时定量方法补充，用于量化这些类群的丰度。早期分子研究（2000年代初）着重描述N循环微生物类群的多样性和丰度，揭示了比先前认知更大的多样性，以及环境和人为因素对分布的控制。功能类群间的生态位分化模式变得明显，反映了生态策略差异和对环境条件的响应。研究逐渐将微生物活性测量纳入，以连接丰度/多样性与过程速率和N₂O排放，但部分研究显示显著相关性，部分则强调高变异性，凸显了连接微生物群落生态与生态系统功能的复杂性。

**4.3 参与N₂O通量的微生物多样性扩展及截断途径的重要性**
氨氧化不仅限于氨氧化细菌（AOB），也由氨氧化古菌（AOA）完成，这一突破后，多项研究证明AOA也能产生N₂O，尽管产率通常低于AOB。随后Comammox *Nitrospira*（完全氨氧化）的发现进一步扩展了硝化菌多样性，其N₂O产量较低。真菌反硝化系统基于铜亚硝酸盐还原酶（NirK）和细胞色素P450一氧化氮（NO）还原酶，但缺乏N₂O还原酶，使N₂O成为终产物，这一特征在真菌中广泛存在。真菌对N₂O生产的贡献在某些土壤中显著，有时超过细菌。真菌以及部分细菌中这种截断的反硝化途径挑战了经典反硝化作为完整途径的传统观点，支持过程的分模块组织，其中部分生物缺乏还原N₂O的遗传能力。这对N₂O排放有重要影响，表明N₂O还原不仅受环境或生理因素控制，还受微生物群落组成内在约束，特别是具备N₂O还原遗传能力的生物的相对丰度。

**4.4 微生物N₂O汇——从发现到减缓策略**
在Chapuis-Lardy等人（2007）强调土壤作为N₂O汇潜力的里程碑式综述之后，一项重大突破是发现了先前未被识别的N₂O还原酶基因（nosZ）分支——nosZII，该分支广泛分布且通常与经典nosZI一样丰富。许多nosZII成员缺乏其他反硝化基因，因此是纯粹潜在的N₂O汇，不贡献N₂O生产。后续研究表明土壤N₂O汇容量主要由nosZII的丰度和多样性解释，且nosZII与原位N₂O排放呈负相关。实验证实，向土壤接种非反硝化nosZII细菌可显著降低N₂O排放，为nosZ富集作为减缓策略提供了概念验证。