对赫布样长时程增强的联想装置的探寻——意外参与者

《Hippocampus》：The Quest for the Associative Device for Hebbian-Like LTP—The Accidental Participant

　　

1985年，Holger Wigstr?m（已故）与研究人员共同发表了一个关于海马赫布样长时程增强（LTP）诱导的设想方案，以解释其输入特异性和协同性。在该方案中，LTP由通过电压依赖性NMDA受体（NMDAR）通道的钙离子（Ca²⁺）内流诱导，这些通道与介导LTP表达的谷氨酸受体通道（非NMDA）共定位。研究人员认为，这种共定位解释了输入特异性，而NMDAR通道的电压依赖性解释了协同性。本文将描述这一设想方案如何从研究人员的研究发现中诞生：阻断突触后抑制后LTP诱导显著增强，观察到一个与成功LTP诱导相关的树突状（可能为再生性）事件，以及认识到这些事件是NMDAR激活的结果。研究人员将描述观察到这些受体通道与非NMDA受体通道在突触上的可能共定位，前者贡献了一个具有较慢起始和更长持续时间的兴奋性突触后电位（EPSP）成分。最后，研究人员将描述这一设想方案如何通过实验验证——将单个EPSP与注入电流脉冲诱发的去极化（在时间上与NMDA成分关联）进行配对。本文将以从这些实验中获得的关于赫布样LTP的一些核心结论结束：这种形式的突触学习很可能仅在去抑制条件下发生；其持久性强烈依赖于诱导强度，从几分钟到更长；在强诱导事件下，它可作为一次性的增强作用；其关联时间窗口可能保持数百毫秒。最后，赫布样LTP很可能进化用于关联输入事件，而非输入事件与胞体峰电位活动。

1 引言
1985年初，Holger Wigstr?m（于2024年不幸去世）与研究人员在《Acta Physiologica Scandinavica》上发表了一篇关于LTP诱导的论文。基于海马突触的实验数据，研究人员提出LTP并非一种后强直形式的突触可塑性，而是可由单个突触前递质释放事件诱导。该单次释放（在每个棘突上）会导致谷氨酸结合两种类型的突触后受体：非NMDA（α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体，AMPAR）型介导通常观察到的EPSP，以及NMDA（NMDAR）型产生一个通常沉默的、具有较慢起始和较慢衰减的EPSP。在此暂定的NMDA EPSP期间施加的强突触后活动应会打开电压依赖性和钙离子通透性的NMDAR通道，导致突触后钙离子内流和LTP诱导。钙离子内流仅局限于被激活的棘突，以及NMDAR通道的电压依赖性，分别解释了LTP的输入特异性和协同性要求。同年春季晚些时候，研究人员以《Nature》信件形式投稿了一篇论文，表明在低频（0.2 Hz）刺激下引发的单个测试EPSP（在海马CA3-CA1连接处）与通过细胞内微电极注入电流脉冲诱发的突触后活动配对时，可诱导LTP，并且该LTP在NMDAR拮抗剂存在下被阻断。这些结果强烈表明，研究人员的提议揭示了支撑LTP诱导赫布样特征的联想装置。它们也明确地将这些突触的LTP与后强直易化/增强过程区分开来。然而，经过与《Nature》近半年的反复沟通，该文章最终被拒。1989年，Holger和研究人员因这项工作获得了奥尔登-斯宾塞奖（哥伦比亚大学），该奖项设立于1978年，旨在表彰在领域内做出杰出研究贡献的科学家。

2 个人背景
那么，研究人员是谁？Holger Wigstr?m在瑞典中南部主要城市延雪平（被称为瑞典的圣经地带）上学。随后他搬到西海岸的哥德堡（瑞典第二大城市），进入查尔姆斯理工大学攻读土木工程专业，专攻物理和数学。此后，在20世纪70年代早期至中期，他参与了一个基于赫布学习规则的神经网络模型博士项目。在完成这些理论工作后，他前往奥斯陆的Per Andersen实验室学习如何使用体外海马脑片制备来研究LTP。20世纪70年代末，他回到哥德堡，在医学院的神经生理学部门建立了一个体外海马脑片制备系统。后来（1989年），在给Per Andersen的生日信中，Holger表示他此前对在这种微小的结构（约400微米厚）中研究大脑过程的价值持怀疑态度，但很高兴Per说服了他认识到其价值，现在他认为脑片是一个“属于自己的宇宙，而研究人员是刚刚开始旅程的旅行者”。研究人员有两个哥哥，像Holger一样在查尔姆斯学习成为土木工程师，而研究人员则进入了家乡哥德堡的医学院。尽管完成了五年半的基础医学课程，但研究人员在第二年的生理学课程中已被神经生理学的工程/生物物理方面所吸引，并在20世纪60年代末以医学生身份加入了神经生理学部门。虽然实验室主要关注猫脊髓神经元回路，但偶尔也研究神经细胞生物物理特性。在一项关于背侧脊髓小脑束（DSCT）细胞的研究中，他们注意到这些细胞由细胞内注入电流诱发的放电以及峰电位后后电位与运动神经元有很大差异，表明这两类神经细胞在放电调控机制上不同。研究人员被问及是否愿意进一步研究这个问题，答案是肯定的。因此，从医学生开始，到博士生，再到后来的各种临时职位，研究人员在20世纪70年代的研究主要集中在这个问题上，经常与一位有闲暇时间参与其预期项目的访问科学家合作。本质上，研究人员证明了运动神经元和DSCT细胞之间的放电行为差异仅基于同一控制机制（很可能是钙离子激活的钾电流）的幅度、动力学和总和特性差异，这些差异对于将神经元从整合细胞（运动神经元）转变为中继细胞（DSCT）很重要。当时，部门按字母顺序排列作者。Holger回到哥德堡后，研究人员与他合作的主要目标是将这些关于放电调控的研究扩展到使用CA1/CA3锥体细胞的体外制备系统。因此，在开始共同进行体外脑片实验时，研究人员已有超过10年的神经细胞实验工作经历，首次胞内记录在20世纪60年代末，但均与突触传递无关。在1981年至1986年期间，研究人员的体内工作仍在进行。1986年，研究人员因“神经细胞功能的生物物理研究”获得了安德斯·耶尔医学北欧奖（挪威奥斯陆大学），该奖项授予40岁以下的年轻研究者。

3 实验环境
如上所述，20世纪70年代哥德堡的神经生理学主要包括以猫脊髓为重点的体内研究。研究人员的导师Anders Lundberg在20世纪60年代初，于1949/1950年在洛克菲勒研究所（纽约）跟随Lorento de Nó进行博士后研究，以及1956/1957年在堪培拉与Eccles作为特邀客座研究员之后，在哥德堡创建了一个研究环境，该环境不仅以其脊髓神经元回路及其控制的研究而闻名，还以其高水平的电子/机械仪器设备而闻名。这里持续有访问科学家和博士生，其中一些人后来取得了辉煌的职业生涯，要么留在实验室（如Elzbieta Jankowska），要么在别处建立自己的实验室（如Sten Grillner）。在这样的环境中建立体外实验室既带来了好处也带来了挑战。作为减震台，Holger利用现有设备临时拼凑，使用为猫实验设计的桌子，并将其放置在装满沙子的盒子里，中间夹着充气良好的小型自行车内胎，从而创建了一个双层桌面。他获得了一个“奥斯陆浴槽”，但由于没有泵，研究人员不得不依赖重力驱动流动，这使得在缺乏再循环的情况下药物应用有些棘手。从研究人员的出版物可以看出，药物通常通过微吸管以液滴形式施加到脑片表面。经过一些练习，这种应用方式很容易操作，而不影响记录/刺激条件。体内环境的一个明显优点是，哥德堡投入了大量时间和精力制造定制设备，以实现定位刺激和记录电极的机械稳定性，以及用于控制刺激参数的设备。在这个数字时代，研究人员不禁怀念那种手动模拟控制的便捷性。

4 LLP 与 LTP
Holger和研究人员在1985年初发表的论文实际上并非关于LTP诱导，而是关于LLP（长时程增强）诱导。LLP是Bliss和L?mo在1973年论文中使用的术语，是该现象首次恰当描述，并且Holger在奥斯陆时也使用该术语。秉承这一斯堪的纳维亚传统，Holger和研究人员在此引用的大部分文章中都使用了LLP。然而，值得注意的是，即使在1973年的论文中，Bliss和L?mo偶尔也将其称为长时程增强（long-term potentiation），而LTP也被其他同时代作者使用，LTP显然是一个更受盎格鲁-撒克逊人喜欢的缩写。事实上，如果相信Tim Bliss的说法，缩写LLP对盎格鲁-撒克逊人来说是一个绕口令，而对于斯堪的纳维亚人则不然。尽管如此，在1985年以Cliff Abraham形式出现的盎格鲁-撒克逊人（在其于Goddard实验室完成博士后之后）到达实验室后，研究人员在1986年从LLP切换到了LTP，以免成为异类。其他名称，如长时程增强（long-term enhancement），也曾被使用。在本文中，无论被引作者使用何种名称，研究人员将统一使用LTP。

5 协同性
当Holger和研究人员在20世纪80年代初开始研究时，已知LTP背后的突触反应增强对激活的突触具有特异性。与先前已知的短时突触可塑性过程相反，LTP诱导似乎依赖于激活突触的数量。这种LTP诱导的协同性要求已在穿通纤维-齿状回颗粒细胞突触（PP-DG突触）和Schaffer侧支-CA1锥体细胞连接（CA3-CA1突触）上得到了更系统的研究。虽然这种共同活动常被发现与动作电位活动相关，符合赫布突触的特征，但更仔细的观察表明，峰电位既不是LTP诱导的充分条件也不是必要条件。例如，激活体细胞投射的抑制性通路可以抵消强兴奋性作用产生的动作电位输出，而不影响LTP诱导。在强直传入激活中添加一个逆向峰电位序列以增加CA1神经元的峰电位活动，并不影响产生的LTP量。虽然不排除通过共同活动突触释放某些化学物质进行协同作用的可能性，但普遍观点是突触后侧的协同作用，即共同活动的突触越多，树突干上的局部去极化越大。这种局部去极化可能随后通过触发钙离子峰电位侵入激活的棘突来诱导LTP。然而，Holger与McNaughton和Barnes合著的一篇论文挑战了这一观点。他们发现，在传入强直刺激期间通过注入电流脉冲施加大的体细胞超极化无法影响产生的LTP量。作者对此结果的解释是，任何共同活动的整合都是化学性质的，而非电性质的。

6 无抑制脑片
研究人员认为Holger对上述结果感到有些沮丧，而研究人员在海马脑片上的联合工作始于与LTP无关的研究，例如参与放电调控的CA1/CA3锥体细胞的电特性。例如，与慕尼黑的一个小组合作，研究人员描述了哺乳动物神经元中存在一种瞬时外向电流，即所谓的A电流，它强烈影响这些细胞的兴奋性。然而，研究人员记得，在1982年初从慕尼黑短暂停留回来后，Holger告诉研究人员，他已经开始研究在浴液中加入γ-氨基丁酸A型受体（GABA_AR）拮抗剂后的LTP，并获得了有趣的结果。在他的神经网络模型中，Holger将树突抑制视为控制突触可塑性的一个组成部分。当时已明确，CA1区Schaffer侧支的激活不仅导致单突触兴奋性突触后电位（EPSP），还导致树突定位的前馈双突触抑制性突触后电位（IPSP）。因此，尽管有上述阴性结果，Holger仍然认为值得尝试看看当这种抑制被阻断时会发生什么。回顾起来，很明显，在没有抑制的情况下研究LTP是一种双赢的局面。抑制可以被排除在观察到的测试突触反应变化之外，并且对协同性的电学与化学解释进行了测试，而无需改变共同活动兴奋性突触的数量。研究人员不记得是否对GABA_A受体阻断后预期的癫痫样活动进行了测试。无论如何，对于这种“无抑制”脑片，在CA3和CA1之间进行了切割，并提高了浴液中钙离子和镁离子的浓度以降低膜兴奋性，增加的镁离子也减少了由增加钙离子带来的释放概率增加。这种“无抑制”海马脑片制备的引入对研究人员来说非常有益，这种制备从此成为研究LTP的最有用的工具。这种阻断对LTP诱导的影响是戏剧性的。通常无效的单次10脉冲序列（50 Hz）现在在CA3-CA1突触上产生了显著的LTP，甚至2脉冲序列也能产生一些LTP。这些结果于1983年初作为致《Nature》的信件发表，后来作为完整报告发表。对于PP-DG突触，结果更为戏剧性。在体外脑片制备中，这些突触很难诱导LTP，几乎所有数据都来自体内实验。研究人员的实验揭示了一种强的前馈抑制，当通过药理学阻断时，很容易允许显著的LTP诱导。研究人员似乎记得Cliff Abraham是因为听到这个关于PP-DG突触的结果而来访，后来与研究人员合作。对研究人员来说，相同的传入刺激在允许产生更大的树突去极化时，如此大大地促进了LTP诱导，这似乎强烈支持突触共同活动的电学整合而非化学整合。那么，为什么在Holger与McNaughton和Barnes合著的文章中，大的体细胞超极化未能影响LTP诱导？研究人员认为，如果这些作者考虑到在强直刺激诱导的EPSP/IPSP突触弹幕期间树突膜比单个测试EPSP期间具有更大的漏电性，他们就不会从这些实验中得出任何结论。然而，研究人员担心，那篇提出化学整合而非电学整合的文章可能对几年后研究人员向《Nature》投稿的命运产生了影响。

7 NMDA受体的参与
使用“无抑制”脑片还有一个研究人员未曾预料到的额外好处。由于可以使用非常短的序列来诱导LTP，研究人员的注意力被吸引到这些序列期间场反应的确切性质上。研究人员观察到在序列期间场电位出现缓慢发展的负性，给人一种树突再生性事件的印象，这在对照溶液中未观察到。事实上，在这些实验中，研究人员打开了扬声器（正如研究人员在体内实验中习惯的那样），并且研究人员想象每当听到与该负性出现相关的特定声音时，LTP就会随之而来。因此，一个额外的树突去极化，甚至可能是再生性过程（突触或非突触），似乎在无抑制脑片中发生了，作为LTP诱导的可能相关物。现在，假设协同性由树突去极化水平解释，那么什么解释了输入特异性？当时，人们认为棘突头部钙离子浓度的增加可能是LTP诱导的最终触发因素。但是，如果是这样，树突去极化水平、棘突头部钙离子和输入特异性之间的物理联系是什么？为什么钙离子只积累在活跃的突触中，或者，如果积累在所有突触中，为什么只作用于活跃的突触？此时，来自其他研究小组的各种数据开始积累。使用离子电泳应用，发现谷氨酸受体的NMDA型存在于CA1锥体细胞上，这些钙离子通透性的NMDAR通道的打开是电压依赖性的。还发现应用NMDAR拮抗剂在某种程度上会损害LTP诱导，并且，不幸的是，研究人员发现缓慢发展的负性被NMDAR拮抗剂阻断。经过一段时间，研究人员意识到，如果这些NMDAR通道与负责通常观察到的EPSP（非NMDAR通道）的谷氨酸受体通道共定位，那么输入特异性就会有一个简单的解释，因为钙离子内流会自动限制在活跃的突触中。研究人员最初对这个想法有些抵触，因为研究人员看不到如何避免自身增强。为什么不是每一次突触激活都导致NMDAR激活，从而产生LTP，因为非NMDA EPSP成分提供了大的棘突膜去极化？在研究人员1985年初发表的提议论文中，研究人员简单地假设NMDAR通道必须具有缓慢的动力学，并且在棘突去极化基本结束之前无法打开。据研究人员所知，当时没有人描述过由NMDAR通道介导的突触电位。对CA1-CA3和PP-DG突触的研究表明，只有非NMDA受体参与突触反应。利用NMDAR通道的电压依赖性由镁离子电压依赖性阻断这一发现，研究人员制备了“无镁”浴液。研究人员发现此溶液中的场兴奋性突触后电位（fEPSP）具有一个额外的缓慢起始和长持续时间的成分。使用胞内记录，研究人员在正膜电位下检查了该EPSP以消除其电压依赖性。刺激强度变化引起大范围的EPSP峰值幅度，表明两个EPSP成分平行增加。因此，这些NMDAR似乎是突触受体，可能与非NMDA受体共定位，正如研究人员所提议的。研究人员不知道是什么使这个共定位概念如此迅速地被接受。当Bekkers和Stevens通过检查培养海马神经元的“微小兴奋性突触后电流（mini）”描述突触中共定位时，他们介绍这种共定位是LTP的核心假设，并且根据他们的参考文献列表，Holger和研究人员已经是史前史了。事实上，发现只有一种受体类型的突触（所谓的AMPA沉默突触，或在哥德堡称为AMPA不稳定突触）几乎被视为异常。无论如何，这一概念的迅速接受意味着研究人员不觉得有义务提供比在巴黎会议（Gif Lectures in Neurobiology; Synaptic regulation and plasticity）上发表的更多数据。仍有一个潜在的担忧，由Cliff Abraham指出，即短暂强直刺激期间的NMDAR激活只是作为协同性因子。因此，NMDAR拮抗剂阻断LTP可能只是减少树突去极化的结果，如同减少共同活动突触数量，使去极化现在低于LTP的阈值。当LTP由传入强直刺激诱导（去极化仅通过突触活动实现）时，这一论点似乎有分量。然而，当去极化主要由注入电流提供，且突触参与仅包括单个EPSP时（如下文所述实验），这一论点对研究人员来说似乎分量小得多。为了进一步反驳这一论点，研究人员使用了几乎“无镁”（0.1 mM）的浴液，这将允许NMDAR通道在阈下膜电位打开。这种浴液允许在短暂序列刺激期间几乎没有突触后放电的情况下显著促进LTP诱导。在研究人员看来，这一结果强烈支持NMDAR激活，而非树突去极化本身，是LTP诱导的关键因素。然而，研究人员记得Cliff Abraham对这些反驳并不特别印象深刻，认为它们过于间接。

8 配对实验
尽管如此，现在已准备好通过将单个EPSP与在NMDAR成分期间定时发生的突触后去极化配对来测试研究人员提出的LTP诱导方案。考虑到通过细胞内体细胞电流脉冲未能影响LTP诱导，Holger对使用这种技术有些谨慎。相反，研究人员开始反复将单个场EPSP与对另一组传入纤维（均在辐射层）的短暂（通常为3脉冲）50 Hz序列配对。配对程序产生了LTP，该LTP达到了通过强直刺激该输入获得的LTP的相当大一部分，并且如果之前有这种强直刺激，则完全被阻断。重要的是，研究人员发现将条件序列刺激定位在腔隙层（stratum oriens）也能获得LTP，即条件去极化必须通过细胞体才能影响辐射层中的测试突触。研究人员记得Holger对这个结果感到相当宽慰，这意味着注入胞体的电流应该能够诱导LTP。如本文开头所述，如果注入电流脉冲与EPSP适当定时，LTP确实是由纯电学产生的突触后活动诱导的。被《Nature》拒绝的文章版本发表在《Acta Physiologica Scandinavica》上，随后在《Journal of Neuroscience》上发表了完整论文。与先前的协同性研究一致，体细胞动作电位既不是充分条件也不是必要条件。因此，当与单个EPSP配对时，注入电流必须在其100 ms持续时间中产生超过5个峰电位（即峰电位不是充分的），并且注射阻断峰电位活动的局部麻醉剂未能阻断LTP（即峰电位不是必要的）。本质上，对研究人员提出的赫布样海马LTP联想诱导方案的实验验证已经完成。与研究人员使用电流注入的结果基本一致，Kelso等人表明，将弱传入强直刺激与通过注入电流产生的突触后活动配对可导致LTP。如同研究人员的情况，突触后峰电位活动不是必需的；注射阻断峰电位活动的局部麻醉剂未阻断LTP，表明这些突触是“伪赫布”而非赫布。然而，树突去极化与LTP诱导耦合的方式未被探索。在同一年发表的一篇论文中，作者使用类似于研究人员的配对方案（单个EPSP和注入电流），表明LTP以这种联想方式被诱导。第一作者曾于1984年访问过研究人员的实验室，当时研究人员刚开始进行配对实验，但他并未根据研究人员的方案解释这一结果，而是似乎倾向于突触后/突触前联合过程。事实上，在之前的一项研究中，他曾提出NMDAR阻断剂并不阻断LTP，而是掩盖它。这种阻断剂的作用被研究人员驳斥。随着20世纪90年代初全细胞记录的出现，出现了研究人员LTP诱导配对方案的一种变体，其中低频激活与接近零膜电位的稳定膜去极化配对。无意中，这一程序也为评估NMDAR激活在LTP诱导中的作用创造了更优化的条件。在这种实验情况下，由NMDAR拮抗剂观察到的LTP诱导阻断不太可能与消除作为协同性因子的NMDAR激活有关。研究人员认为，即使是Cliff Abraham也会对这个论点感到满意。

9 结论
为了总结这一故事，研究人员将就所使用的特定LTP诱导方案，讨论关于这种赫布样LTP的一些额外要点。作为体外实验，研究人员的实验是在非生理条件下进行的，但研究人员不认为“无抑制”脑片引入了任何额外的非生理性。相反，如果大多数突触学习实际上发生在去抑制条件下，使其能够像在脑片中一样快速强烈地产生，研究人员将不会感到惊讶。所有以这种赫布样方式诱导的增强并不都是LTP，即稳定持续至少30-60分钟（这是脑片制备中通常的标准）。相反，在较弱激活下，它可能作为赫布样短时程增强在几分钟内消失。研究人员的诱导方案也使得能够评估LTP（对于一群突触）开始表达所需的时间，同时最小程度地干扰其他形式的可塑性。LTP（在30°C下）具有几秒的潜伏期和15-20秒的增长阶段。考虑到冷却至25°C时这些值加倍，那么在体温下它们至少会减半。也就是说，在行为测试情境中，突触预计在10秒或更短时间内被增强。由单个配对事件激活的突触群表现出相当适度的LTP，约10%。然而，考虑到受增强的突触输入以短暂爆发形式传递，LTP可以作为一种一次性增强，前提是有足够的突触后活动。例如，仅对PP-DG突触施加单个5脉冲强直刺激，测试EPSP可以增加到基线以上50%，这是一个非常显著的LTP。关于配对实验，研究人员认为很容易忽视一个事实，即任何在谷氨酸仍结合于NMDA受体时发生的强去极化都会导致这些通道打开以及钙离子内流和有助于突触后细胞放电的电流。在胞内记录中，将膜电位维持在+30 mV，研究人员发现一个相当大的NMDAR介导的EPSP成分在单个EPSP起始后200 ms仍然存在。在使用去极化电流脉冲的配对实验中，也有在EPSP起始后200 ms递送脉冲诱导LTP的例子。因此，在将联想结合归因于此处概述之外的机制之前，应了解测试EPSP/ EPSPs之后NMDAR介导的EPSP的时间窗口。值得注意的是，约200 ms的时间窗口在空间地图形成的建模研究中取得了成功。体细胞峰电位激活的实际作用是什么，即“赫布特性”的本质？毕竟，对于将神经元用作“细胞组装”中的构建块，输入和输出活动的时间一致性至关重要。尽管在各种实验情况下，突触后细胞的放电已被发现既非LTP诱导的必要条件也非充分条件，但在自然条件下，即使在两者之间没有物理耦合的情况下，LTP的产生可能与突触后放电高度相关。考虑到现在揭示的LTP诱导的突触后条件，两者之间可能存在某种程度的物理耦合，特别是如果体细胞峰电位活动导致反向传播。然而，应该指出，有点讽刺的是，研究人员对赫布样LTP联想装置的探寻是在一个体细胞峰电位活动对突触学习可能影响有限的区域进行的。例如，在CA1区，学习的关联更可能是远端顶树突（腔隙层-分子层，SLM区域）和近端顶树突（辐射层，SR区域）到达的突触输入之间的关联。也就是说，本文描述的LTP诱导装置可能进化用于输入事件之间的时间关联，而非突触事件与体细胞峰电位活动之间的关联。