一种经过系统评估的用于检测人血清中锰、铁、铜和锌形态的SEC-ICP-MS/MS分析流程

《Talanta》：A systematically evaluated SEC-ICP-MS/MS workflow for Mn, Fe, Cu, and Zn speciation in human serum

　　摘要：对血清中必需过渡金属的物种分辨分析能够提供超出总元素浓度的生物学和临床相关信息，尤其是在金属分布改变与毒理学或疾病过程相关联的情况下。然而，血清中金属的物种分析在技术上具有挑战性，因为许多金属-蛋白质及金属-配体相互作用较为不稳定，相关组分涵盖广泛的分子量及浓度范围，且通常缺乏特定物种的标准品。本研究提出了一种新开发的尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体串联质谱（SEC-ICP-MS/MS）分析方法，用于检测人类血清中的锰、铁、铜和锌的物种组成。该方法结合了生物惰性色谱技术、温和的流动相条件以及整个色谱系统内的基质匹配校准。重要的是，通过使用两种质量控制材料及两种真实人类血清样本，在五天的检测时间内对该方法的分析性能进行了系统评估，这一方面在以往的多元素血清物种分析研究中较少得到关注。色谱响应显示出优异的线性度，经过色谱分离后的元素总回收率在96%至102%之间。主要物种的日内变异系数低于1.5%，日间变异系数低于5%，而其余组分的相关数值则分别保持在10%和15%以下。所有研究元素的定量下限均足够低，甚至包括含量较低的锰。该方法能够可靠地区分四种锰、三种铁、五种铜和四种锌的物种，其中大多数可初步归类为具有生物学合理性的蛋白质。总体而言，该方法提供了一种经过系统评估的多元素分析平台，有助于将血清金属物种分析从以探索性应用为主的发展方向，推向更复杂的生物监测、职业健康及临床研究领域。

引言：生物基质中的总元素浓度被广泛用于人类生物监测和临床微量元素分析，作为暴露程度、营养状况及疾病相关过程的标志物[1]。然而，仅总浓度往往无法充分反映元素的生物利用度、分布情况及其毒理学意义。在很多情况下，元素的生物学和毒理学行为不仅取决于其总浓度，还与其化学形态有关。因此，物种分辨分析能够为金属稳态、与疾病相关的改变以及暴露引发的生物学效应提供更具机制意义的见解[2]。对于砷、汞和硒等元素，在环境、生物及临床基质中的物种分析方法已取得显著进展[3][4]，但将其类似的分析策略应用于血清中的必需过渡金属则更具挑战性，因为相关形态多为不稳定的金属-蛋白质及金属-配体复合物，而非结构明确、分子量较低的共价化合物。正因如此，血清中必需过渡金属的物种分析在方法上要求更高，且标准化程度也低于那些目标物种更为明确、分析更为便捷的元素[2][5]。锰、铁、铜和锌在此背景下尤为重要，因为它们是参与多种酶促反应、结构功能、物质运输及氧化还原过程的必需过渡金属[6]。但在血液循环中，这些元素并非以单一均匀的形式存在，而是分散在不同蛋白质相关组分及低分子量组分中[7]。这一特点具有重要的生物学意义，因为不仅是元素缺乏或过量，其在循环组分中的分配失衡也可能破坏金属稳态，进而导致与暴露相关的功能损害或病理状态[6][8][9]。此外，锰、铁、铜和锌的稳态并非完全独立，而是可能通过重叠的结合伴侣、共享的转运途径以及对循环配体的竞争而相互关联[10][11][12]，这些相互作用进一步支持从整体角度进行联合分析，而非单独考虑各元素。锰虽为必需微量元素，但在高暴露条件下却可能产生神经毒性作用[13]，这在焊接等职业环境中尤为突出，长期接触锰会导致神经系统损伤以及一种类似帕金森病的疾病——“锰中毒”[14]。在此背景下，物种分辨信息显得尤为重要，因为包括柠檬酸结合形式在内的低分子量锰复合物被认为可能与锰的转运及神经毒性行为有关[15][16]。铁的情况虽不同，但同样重要。在生理状态下，循环中的铁主要与转铁蛋白结合，而病理状态下未与转铁蛋白结合的铁组分可能具有氧化还原活性，被认为具有潜在毒性[17]。铜则主要与铜蓝蛋白一同转运，血清中铜的分布异常在威尔逊病等疾病中具有临床意义[18][19]。而锌则主要与白蛋白结合，部分与α2-巨球蛋白结合[20]。综上所述，对于锰、铁、铜和锌而言，具有生物学意义的信息不仅存在于总浓度中，还体现在这些金属在循环组分中的分布情况，这进一步支持对其开展联合分析。尽管物种分辨分析具有明确的生物学和临床价值，但对含金属的血清组分进行分析仍面临诸多技术挑战。许多关键的金属-蛋白质及金属-配体相互作用为非共价性质且不稳定，因此除非在整个分析过程中尽可能维持接近生理状态的条件，否则原有的金属分布可能会发生改变。此外，目标分析物的化学和分子范围极为广泛，从低分子量的无机物或配体结合复合物到高分子量的金属蛋白都有可能存在，且它们的浓度差异也很大。在多元素分析中，这一问题尤为突出，因为目标元素的绝对浓度以及各组分的含量都可能存在显著差异。对于锰而言，这一挑战更为明显，因为它在血清中的浓度通常远低于铁、铜和锌，因此在多元素分析体系中更难以检测到[21]。此外，锰(II)形成的复合物通常比其他过渡金属的相应二价离子复合物更不稳定，这与欧文-威廉姆斯序列所描述的稳定性趋势一致[22][23]。因此，含锰的组分在样品处理和分离过程中可能更容易发生配体交换、解离或重新分布，这使得对其进行可靠表征显得尤为困难。另外，许多相关含金属组分缺乏成熟的商业标准品，这不仅增加了校准的难度，也使得物种的准确鉴定变得复杂。 Consequently，分析信号往往代表操作上定义的组分，而非结构已完全确定的化学实体。综上所述，这些限制使得可靠的血清金属组分分离分析极具挑战性，也大大限制了可用于血清金属物种分析的分离方法种类。因此，方法选择不能仅依据分离能力来决定，而必须注重保持元素的自然分布状态。这就限制了那些常用于蛋白质分析或低分子量化合物分离的变性处理、强相互作用或非自然状态的方法的应用。相比之下，更合适的分析方法包括基于天然凝胶的技术、毛细管电泳以及相对温和的色谱方法[2][24][25][26]。其中，尺寸排阻色谱因其能够在相对温和的条件下分离高分子量和低分子量组分，且对特定分析物与固定相之间的相互作用依赖性较低，因而尤为适用。结合基于ICP-MS的在线检测技术，尺寸排阻色谱非常适合用于分析含金属的血清组分中的多种元素。基于尺寸排阻色谱的方法已经证明了多元素血清金属组分分离分析的可行性及其生物学意义[27][28][29]，但目前的相关研究在方法学上存在较大差异，分析范围、校准策略、样品需求以及方法可靠性的证明程度各不相同。在一些研究中，组分浓度是根据总元素浓度和相对峰面积百分比得出的，没有采用专门的针对特定物种的色谱校准方法[7][9]；还有些研究试图使用金属氯化物或每种元素仅一种金属蛋白标准品进行校准，有时甚至不经过色谱系统，因而无法考虑物种间的保留行为差异以及分析物在色谱柱中的可能变化[30][31][32]，这可能会影响所得组分数据的定量可靠性。此外，由于锰在人类血清中的含量较低，其定量下限往往不够低，难以实现对具有生理意义的含锰组分的可靠分析[30]。同时，关于真实人类血清样本中方法精度的系统数据也非常有限，尤其是关于所得金属物种模式的日内和日间稳定性方面的数据。综合来看，目前仍需要一种实用且分析可靠的 方法，用于同时分析血清中的锰、铁、铜和锌组分。在本研究中，研究人员开发了一种尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体串联质谱（SEC-ICP-MS/MS）方法，并对其进行了分析评估，用以同时分析人类血清中的锰、铁、铜和锌的物种组成。该方法特别注重采用温和的分析条件及生物惰性实验装置，以保持元素的自然分布状态。该方法旨在实现低样品消耗和短分析时间下的可靠多元素物种分析，同时将锰作为最具分析挑战性的目标元素纳入分析范围。此外，研究人员还通过在使用总金属浓度已知的商业血清基质中进行全色谱系统范围的校准，建立了一种改进的校准策略，相比仅基于金属盐或单一金属蛋白的校准方法，这种策略能为定量分析提供更准确的依据。研究人员的分析性能评估使用了两种市售的血清质量控制材料以及两种真实人类血清样本，评估内容包括色谱重复性、日内和日间稳定性以及整个色谱系统中的校准表现。该分析流程有望为生物监测及相关生物分析领域的血清金属物种分析提供支持，也可能为在复杂生物基质中进行常规化的血清金属物种分析奠定基础。

章节摘录：化学品、标准品及材料：牛超氧化物歧化酶、牛甲状腺球蛋白、人全转铁蛋白、锰(II)柠檬酸、三碱式柠檬酸钠二水合物以及pH值为7.4的Tris盐酸盐均购自Sigma-Aldrich公司（美国马萨诸塞州伯灵顿市）。氯化铵、甲醇、磷酸缓冲液（0.5 M，pH 7.0）以及硫酸则购自Thermo Fisher Scientific公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）。氰钴胺、锰(II)氯化物四水合物以及95%（重量/重量）的硫酸则从其他供应商处购买。

尺寸排阻色谱校准与组分鉴定：尺寸排阻色谱校准为在较宽的分子量范围内准确鉴定色谱组分提供了可靠依据。所使用的标准品覆盖了主要金属蛋白组分出峰的SEC分离范围，且出峰顺序与预期一致（见图1A）。在该范围内，保留时间与分子量的对数之间存在明确的线性关系，从而形成了高度相关的校准曲线（见图1B）。

SEC-ICP-MS/MS物种分析方法：血清中必需过渡金属的物种分析面临多重挑战。首先，许多相关的金属-蛋白质及金属-配体相互作用为非共价性质且不稳定，因此在样品处理和分离过程中可能会发生重新分布或解离现象[5]；其次，所需分析的物种涵盖极其广泛的化学和分子范围，从高分子量的蛋白质相关组分到体积较小、分子量较低的金属复合物，它们的性质差异极大。

结论：本研究开发了一种用于同时分析人类血清中锰、铁、铜和锌物种的SEC-ICP-MS/MS分析方法，并对其进行了性能评估。该分析流程结合了温和的色谱条件、生物惰性的样品处理方式以及多元素ICP-MS/MS检测技术，能够在低样品消耗和短分析时间的条件下实现血清金属组分的可靠分离。在五天的检测过程中，该方法显示出的元素总响应具有优异的线性度，元素总含量的测定结果也相当准确。

CRediT作者贡献说明：Andy Schmied负责文章的撰写、审阅与编辑工作；Anne Nagel同样负责撰写、审阅与编辑工作；Johannes Fischer则承担了撰写、审阅与编辑、初稿撰写、方法设计、实验研究以及正式数据分析等工作。

生成式AI使用说明：在准备本文档时，作者们使用了ChatGPT 5.4（OpenAI）工具来进行语言润色和表述优化。所有生成的文本均经过严格审查，必要时会进行修改，最终由作者们确认，他们对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明：? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢：作者感谢Nick Erdmann通过ICP-MS/MS技术独立测定人类血清样本中的总元素浓度所给予的帮助。

图形摘要由BioRender平台制作。相关链接：Fischer, J. (2026) https://BioRender.com/tldvc61
作者：Johannes Fischer | Anne Nagel | Andy Schmied
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