《Talanta》：Self-assembled DNA nanosphere-powered confined-free self-circulating amplifier for high-fidelity microRNA imaging and clinical liquid biopsy
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摘要在复杂的生物基质中监测细胞内的微小RNA时，开发出可预测且热力学稳定的DNA纳米机器仍面临挑战。本研究提出了一种基于受限-自由协同结构的荧光生物传感器，用于精准检测miR-21。为克服均匀催化发夹组装过程存在的热力学限制以及由此引发的背景泄漏问题，该传感器将放大组件进行空间分
摘要
在复杂的生物基质中监测细胞内的微小RNA时，开发出可预测且热力学稳定的DNA纳米机器仍面临挑战。本研究提出了一种基于受限-自由协同结构的荧光生物传感器，用于精准检测miR-21。为克服均匀催化发夹组装过程存在的热力学限制以及由此引发的背景泄漏问题，该传感器将放大组件进行空间分隔。该传感平台由一个通过三个回文序列退火而形成的刚性DNA纳米球构成，该纳米球可作为空间约束支架，有效限制发夹探针1的移动。目标miR-21会促使固定的HP1展开，进而吸引可自由扩散的辅助探针HP2和HP3，形成局部Y形结构。这一反应会产生一种替代性的miR-21序列，该序列会脱离并与相邻的HP1探针结合，从而建立粒子间的化学通信网络。通过将纳米级空间约束与这种级联催化反应相结合，所设计的受限-自由自循环放大器能够有效抑制背景泄漏，同时保持快速的质量传递，其检测下限可达100 pM。此外，密集的3D纳米支架还具有抗核酸酶的能力。经过脂质体介导的细胞递送后，这种受限-自由机制能够有效避免大分子拥挤现象，便于在活癌细胞中实现miR-21的实时动态成像。通过对多个癌症患者群体的临床血清样本进行分析，该CF-SCA纳米平台有望成为一种无需酶的临床诊断和液体活检工具。
引言
微小RNA在调控细胞增殖、分化及凋亡等基本生理过程中发挥着重要作用。某些微小RNA的异常表达，尤其是致癌性微小RNA miR-21，与多种恶性肿瘤的发病、进展及治疗耐药性密切相关[1,2]。因此，快速、灵敏且能实现实时动态监测的miR-21检测方法在早期肿瘤筛查中具有重要的临床价值。传统的金标准检测技术，如逆转录定量聚合酶链反应，已被广泛应用于临床检测[[3], [4], [5]]。然而，这些技术需要复杂的RNA提取过程、严格的温度控制以及特定的蛋白酶，因此不适合用于实时细胞内成像或快速的现场诊断。为解决这一问题，有必要开发出可预测且无需酶的DNA分子机器，以便在复杂的生物基质中获得更优异的检测性能[[6], [7], [8]]。
近几十年来，人们基于链置换扩增原理，开发出了多种无需酶的核酸信号放大策略，包括熵驱动催化[9,10]、催化发夹组装[11,12]以及杂交链反应[13]。其中，催化发夹组装策略因其可预测的编程能力和自主执行能力而在生物传感领域受到了广泛关注[14,15]。典型的催化发夹组装系统能够通过持续的启动子循环，将亚稳态的DNA发夹动态组装成分支结构。然而，传统的均匀催化发夹组装系统依赖于自由漂浮的探针在三维空间中的随机碰撞[16,17]，这种较高的熵自由度容易导致非预期的碱基配对，使得其在复杂生物环境中的稳定性较差。相比之下，将催化发夹组装系统固定在刚性纳米结构表面（如金纳米粒子或复杂的DNA折纸结构），可以有效限制探针之间的碰撞，提升系统的稳定性[[18], [19], [20], [21]]。
尽管在表面约束型DNA纳米机器方面已取得了显著进展，但现有的策略仍存在一些固有缺陷。将所有催化发夹组装系统组件完全固定在纳米支架上，会导致严重的空间位阻，使得反应动力学变慢，质量传递效率也较低。此外，传统的刚性支架在富含核酸酶的环境中往往难以保持结构稳定性，这限制了它们在生物传感领域的应用，尤其是在活细胞中检测微量分析物方面的应用[22,23]。这一持续存在的热力学和动力学难题凸显出在DNA电路设计方面进行范式转变的迫切需求[24,25]。
为克服这些局限性，研究人员开发出一种无需酶的DNA纳米机器，名为受限-自由自循环放大器。与完全均匀或完全固定的设计不同，该放大器采用空间分隔的结构，有助于精准监测miR-21。该系统由一个自组装的DNA纳米球以及三个茎环探针组成，其中捕获探针固定在纳米球上，而两个辅助探针则可在溶液中自由扩散。目标分子与捕获探针结合后，会促使固定的HP1展开，进而吸引未结合的HP2和HP3。这种局部层次化的组装过程会形成Y形DNA结构，其末端片段具有与原始分析物相似的功能。由此产生的替代性miR-21序列会与纳米球网络中相邻的固定HP1探针发生杂交，从而引发空间上的级联反应。通过利用纳米球的空间约束作用作为熵耗散源，限制探针之间的过早相互作用，同时保持辅助探针的自由扩散特性，以确保快速的质量传递，该放大器成功克服了传统表面固定型系统所面临的动力学限制。因此，该平台具备较强的抗大分子拥挤能力，适用于在活细胞中进行实时动态成像，以及在复杂的临床血清样本中进行诊断分析。
章节节选
材料与试剂
所有的DNA寡核苷酸（见表S1）均由上海桑根生物科技有限公司通过高效液相色谱法合成并纯化。这些冻干的DNA序列被重新溶解在1× TE缓冲液中，最终浓度为10?μM。低分子量DNA梯度尺和6× DNA上样缓冲液则由北京新英格兰生物技术公司提供。以下试剂则购自北京鼎国长盛生物技术有限公司：30%
CF-SCA纳米平台的工作原理
miR-21的异常高表达与肿瘤的发生、进展以及化疗耐药性密切相关，因此它成为早期癌症诊断的关键生物标志物。为了实现对miR-21的高灵敏度、高特异性细胞内监测，我们开发了一种基于新型“受限-自由”协同结构的自增强荧光生物传感器。与传统均匀催化发夹组装系统相比，后者由于存在严重的背景泄漏问题
结论
总之，我们开发了一种名为受限-自由自循环放大器的自增强荧光生物传感器，该传感器采用了独特的受限-自由协同结构，能够实现miR-21的超灵敏监测。通过将启动子发夹合理地固定在自组装的DNA纳米球上，同时让辅助探针保持自由扩散状态，我们成功解决了传统均匀催化发夹组装系统中存在的背景泄漏问题
CRediT作者贡献说明
江静：数据整理、研究工作、初稿撰写。林国海：正式分析、研究工作、验证工作。余恒欣：正式分析、软件应用、验证工作。陈立群：资金筹集、项目监督、审稿与编辑工作。徐霍：概念设计、资金筹集、项目管理、监督工作、审稿与编辑工作。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了福建省自然科学基金项目（项目编号：2021J011039）、福建省重大科技项目（项目编号：2022YZ035020）以及闽江大学青年人才培养计划的支持。
Jing Jiang|Guohai Lin|Hengxin Yu|Liqun Chen|Huo Xu
中国福建省福州市福州大学生物科学与工程学院，邮编350108
