嗜热毁丝霉中通过DyP介导的木质素解构解锁生玉米芯联合生物加工生产苹果酸

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Unlocking raw-corncob consolidated bioprocessing for malic acid production by DyP-enabled lignin deconstruction in Myceliophthora thermophila

　　

l-苹果酸（l-Malic acid）是一种重要的C₄平台化学品，但其通过联合生物加工（consolidated bioprocessing, CBP）直接从木质纤维素生物质中生产仍受限于生物质顽抗性。在此，研究人员在嗜热真菌嗜热毁丝霉（*Myceliophthora thermophila*）中开发了一种整合的木质素侧与糖侧工程策略，以提高直接从生玉米芯生产苹果酸的能力。转录组分析和生理表征将木质素相关顽抗性确定为生玉米芯CBP过程中的主要障碍。通过过表达一种染料脱色过氧化物酶（dye-decolorizing peroxidase, DyP）强化木质素侧氧化重塑，提高了苹果酸产量和生物质解构性能，而对处理后的玉米芯残留物进行的傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析支持了该酶在修饰木质素相关结构中的作用。通过改善纤维素解构、纤维糊精摄取及胞内磷酸化加工，进一步强化了碳水化合物转化。最终工程菌株在摇瓶培养中以75 g/L生玉米芯为唯一碳源，产苹果酸55.5 g/L。在5 L生物反应器中，该菌株达到157.6 g/L苹果酸，对应生产率为1.17 g/L/h，产率为0.55 g/g总生玉米芯投入量。经下游处理后，回收产品纯度达99%。通过将生生物质解构与胞内碳转化整合于单一嗜热真菌平台，本工作展示了从农业残余物到有机酸更直接、更低投入的增值路线，并为更绿色的木质纤维素生物精炼提供了实践基础。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
木质纤维素生物质是丰富且可再生的碳源，但传统多步水解-发酵工艺复杂、成本高。联合生物加工（CBP）将酶生产、多糖糖化和发酵整合于单一反应器，简化了操作。然而，未经预处理的生物质对CBP仍存在顽抗性，主要瓶颈在于木质素对纤维素酶的空间阻碍和非生产性吸附。苹果酸作为重要的C₄平台化学品，其从生生物质直接生产仍受限于木质素顽抗性和糖类利用效率。嗜热真菌嗜热毁丝霉（*Myceliophthora thermophila*）具有强木质纤维素降解潜力，但天然木质素解构能力不足。因此，研究人员旨在同时解决木质素侧和糖侧限制，提升生玉米芯CBP生产苹果酸效率。

**研究内容与结论**
研究人员通过转录组分析和生理表征，确认木质素顽抗性是生玉米芯CBP的主要障碍。引入染料脱色过氧化物酶（DyP）过表达，强化木质素氧化重塑，提升苹果酸产量和生物质解构能力。进一步通过过表达纤维二糖水解酶（CBH）、纤维糊精转运蛋白（Cdt-1）和纤维二糖磷酸化酶（CtCpp），增强纤维素解构、纤维糊精摄取和胞内磷酸化转化。最终工程菌株YZ272CDT在摇瓶中产苹果酸55.5 g/L，在5 L生物反应器中达到157.6 g/L，产率0.55 g/g生玉米芯，纯度99%。该研究发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》。

**关键技术与方法**
1. **转录组分析**：对菌株MS917在生玉米芯上培养2、4、6天进行RNA-seq，确定木质素解构相关基因表达弱。
2. **基因过表达工程**：通过PEG介导的原生质体转化，在MS917中分别过表达漆酶（lac1、lac2）和DyP基因，筛选获得YZ272等菌株。
3. **傅里叶变换红外光谱（FTIR）**：分析经不同氧化反应体系处理后的玉米芯残渣，评估DyP对木质素结构的修饰。
4. **超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）**：监测发酵上清液中木质素衍生芳香族化合物的动态变化。
5. **摇瓶与5 L生物反应器发酵**：以生玉米芯为唯一碳源，评价工程菌株的苹果酸生产性能。

**研究结果**
**3.1 木质素解构是生玉米芯CBP的关键瓶颈**
通过时间分辨转录组分析，发现核心纤维素酶和半纤维素酶基因表达强，而推测的木质素降解酶基因（包括DyP）表达弱。体外水解实验表明，添加商业漆酶可显著提高葡萄糖和木糖释放量，说明木质素阻碍多糖可及性。

**3.2 强化木质素解构提升生玉米芯CBP性能**
分别过表达两种漆酶和一种DyP。DyP过表达菌株YZ272在3天和6天苹果酸产量分别提高33%和30%，木质素含量降低61.5%，而漆酶过表达导致生长抑制。表明DyP过表达是有效策略。

**3.3 木质素侧氧化重塑增强生玉米芯胞外糖化能力**
纯化DyP具有ABTS氧化活性。FTIR显示，DyP+ H₂O₂ + ABTS或发酵液系统引起木质素相关芳香族谱带（1510 cm^-1、1600 cm^-1、1260 cm^-1）明显变化。YZ272胞外DyP活性达99.4 U/L，同时内切葡聚糖酶和木聚糖酶活性升高，水解实验释放更多葡萄糖和木糖。

**3.4 时间分辨芳香族化合物谱揭示DyP过表达加速木质素溶解**
UHPLC-MS/MS检测到10种芳香族化合物，在YZ272中积累水平更高。部分化合物（如没食子酸、原儿茶酸）随时间消耗，表明菌株具有内在芳香族同化能力；但松柏醛等持续存在，说明同化能力有限。

**3.5 顺序强化纤维糊精释放与摄取进一步提高生玉米芯苹果酸产量**
在YZ272基础上过表达CBH（得YZ272CBH），6天苹果酸提高5.6%。再引入Cdt-1和CtCpp（得YZ272CDT），6天达到55.5 g/L，较YZ272CBH提高9.7%，产率0.74 g/g玉米芯。

**3.6 生物反应器中放大生产**
5 L反应器以生玉米芯为唯一碳源，总投入900 g，苹果酸最高157.6 g/L，生产率1.17 g/L/h，产率0.55 g/g，纤维素和半纤维素转化率分别为93.2%和94.1%，木质素去除78%，最终产品纯度99%。

**讨论与结论**
讨论指出，DyP过表达有效缓解了木质素顽抗性，并增强了胞外糖化能力，而漆酶过表达导致生长抑制，说明木质素侧强化需酶类型和发酵环境匹配。DyP依赖H₂O₂，发酵液中的天然氧化还原介体可能辅助其作用。芳香族谱显示菌株具有同化多种芳香酸的能力，但对醛类（如松柏醛）同化不足，提示未来可强化芳香族摄取和解毒途径。糖侧工程通过磷酸化裂解纤维二糖减少ATP需求，与木质素侧改造互补。本工作的主要进展在于简化了从农业残余物到产品的路线，无需外部酶添加，且副产物少，产品纯度99%。
**研究结论部分翻译**：在本研究中，研究人员在嗜热毁丝霉中开发了一种整合的木质素侧与糖侧工程策略，以改善生玉米芯联合生物加工生产苹果酸。通过DyP过表达强化木质素侧氧化重塑，降低了生物质顽抗性并提高了胞外糖化能力；随后增强纤维素解构、纤维糊精摄取和胞内磷酸化转化，进一步强化了碳水化合物同化与苹果酸生成。通过这一协调策略，最终工程菌株在摇瓶培养中产生55.5 g/L l-苹果酸，在5 L生物反应器中产生157.6 g/L，总生玉米芯投入产率为0.55 g/g，最终产品纯度达99%。这些结果表明，顺序去除木质素侧和糖侧限制可显著改善嗜热真菌对生农业残余物的CBP。本工作为利用工程嗜热真菌平台将粉碎的木质纤维素原料直接、低投入转化为有机酸提供了实践框架。