铅诱导分化神经细胞毒性的促进作用及硒的保护作用

《Biological Trace Element Research》：Promotion of Lead-induced Cytotoxicity in Differentiating Neural Cells and Protective Effects of Selenium

　　

摘要：铅（Pb）暴露仍然是一个全球性健康问题，尤其是在胎儿发育和儿童期对神经发育的不良影响。在神经元分化过程中，早期生命暴露于铅会损害神经发育，但潜在的分子机制仍不清楚。在本研究中，研究人员使用SH-SY5Y细胞研究了铅在神经分化过程中诱导神经毒性的细胞和分子机制。研究结果表明，铅暴露对分化中的神经细胞造成严重损伤，导致细胞死亡并伴随膜破坏。这种细胞死亡形式对主要调控细胞死亡途径的抑制剂具有抵抗性，但通过添加亚硒酸盐的硒（Se）补充剂或添加硒转运蛋白硒蛋白P（SeP）可显著抑制。转录组和蛋白质表达分析显示，铅诱导了内质网（ER）应激反应。然而，选择性敲低选定的ER驻留硒蛋白，包括SELENOK、SELENOS和SELENOT，并未消除硒的保护作用，表明在现有实验条件下，这些蛋白质均非单独不可或缺的保护因素。过氧化物还蛋白6（PRDX6）敲除的SH-SY5Y细胞表现出降低的硒代谢活性，但仍对硒对抗铅诱导细胞毒性的保护作用有反应。此外，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）模拟物依布硒啉（ebselen）也在这些条件下缓解了铅毒性。这些发现表明，硒通过涉及过氧化物还原活性以及其他硒依赖性途径的机制，保护分化中的神经细胞免受铅诱导的损伤。总之，研究结果提供了铅诱导神经毒性分子基础的新见解，并支持硒依赖性应激抵抗对铅诱导细胞损伤的保护作用。铅（Pb）暴露仍然是一个全球性健康问题，尤其是在胎儿发育和儿童期对神经发育的不良影响。在神经元分化过程中，早期生命暴露于铅会损害神经发育，但潜在的分子机制仍不清楚。在本研究中，研究人员使用SH-SY5Y细胞研究了铅在神经分化过程中诱导神经毒性的细胞和分子机制。研究结果表明，铅暴露对分化中的神经细胞造成严重损伤，导致细胞死亡并伴随膜破坏。这种细胞死亡形式对主要调控细胞死亡途径的抑制剂具有抵抗性，但通过添加亚硒酸盐的硒补充剂或添加硒转运蛋白硒蛋白P可显著抑制。转录组和蛋白质表达分析显示，铅诱导了内质网应激反应。然而，选择性敲低选定的ER驻留硒蛋白，包括SELENOK、SELENOS和SELENOT，并未消除硒的保护作用，表明在现有实验条件下，这些蛋白质均非单独不可或缺的保护因素。过氧化物还蛋白6（PRDX6）敲除的SH-SY5Y细胞表现出降低的硒代谢活性，但仍对硒对抗铅诱导细胞毒性的保护作用有反应。此外，谷胱甘肽过氧化物酶模拟物依布硒啉也在这些条件下缓解了铅毒性。这些发现表明，硒通过涉及过氧化物还原活性以及其他硒依赖性途径的机制，保护分化中的神经细胞免受铅诱导的损伤。总之，研究结果提供了铅诱导神经毒性分子基础的新见解，并支持硒依赖性应激抵抗对铅诱导细胞损伤的保护作用。

**论文解读：铅诱导分化神经细胞毒性的促进作用及硒的保护作用**

**研究背景与问题**
铅（Pb）是一种广泛使用的金属，尤其在供水管道中，但其与神经发育障碍的关联引发了重大公共卫生担忧。世界卫生组织（WHO）将铅列为“十大主要公共卫生关注化学品”之一。尽管存在这些担忧，铅在多种工业应用中仍不可或缺，且未设定明确的使用限制。历史报告记录了含铅油漆的意外摄入可破坏多个生理系统，包括神经、造血和内分泌系统。值得注意的是，在胎儿发育和早期儿童阶段（以活跃的神经分化为特征），铅暴露构成特殊风险。美国疾病控制与预防中心（CDC）在2004年将血铅浓度降低目标设定为10 μg/dL，并在2012年进一步降至5 μg/dL。然而，累积证据表明，低于这些阈值的血铅浓度仍与儿童的不良效应相关，包括智商降低、注意力缺陷、攻击性增强和违纪行为增加。当前铅中毒治疗策略主要依赖螯合剂促进铅排泄，但尚无针对铅诱导神经毒性的特异性治疗干预。这凸显了阐明铅诱导神经毒性精确机制并开发新型治疗方法的迫切需求。

多项机制已被提出解释铅诱导神经毒性。铅已知可与抗氧化酶（如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶）结合并抑制其酶活性，从而诱导氧化应激。它还通过酶抑制和模拟必需金属（如锌和钙）干扰其代谢过程，破坏线粒体功能。在新生小鼠模型中，铅给药导致尾状核和海马体出现明显的神经退行性变。然而，凋亡（一种程序性细胞死亡形式）在铅毒性中的参与似乎有限，且铅毒性背后的精确细胞死亡机制仍不明确。硒（Se）是一种必需微量元素，对人类健康具有重要保护作用。硒缺乏导致严重病理状况，包括心脏肥大、骨骼异常和精子活力降低，而过量摄入也会引起毒性效应，包括脱发、指甲脱落和周围神经病变。硒主要被整合到硒蛋白中，这些蛋白介导硒的生理作用，并在细胞抗氧化防御系统中发挥关键作用。硒蛋白P（SeP，由SELENOP基因编码）是一种由肝脏分泌的血浆蛋白，对硒向大脑的转运至关重要。一旦SeP通过其受体低密度脂蛋白受体相关蛋白8（LRP8；ApoER2）被组织摄取，它被降解以释放无机硒，随后用于细胞内硒蛋白合成。作为代表性硒蛋白，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）可中和活性氧和脂质过氧化物，硫氧还蛋白还原酶（TrxR）通过还原硫氧还蛋白调节氧化还原平衡。一些细胞器特异性硒蛋白据报道在细胞器维持中发挥重要作用。硒蛋白K（SELENOK）参与内质网（ER）相关降解（ERAD）途径，有助于从ER中移除错误折叠或受损蛋白，从而维持细胞蛋白质稳态。这些硒蛋白共同维持细胞氧化还原稳态并保护细胞免受各种应激。鉴于硒的强抗氧化特性和氧化应激在铅毒性中的既定作用，研究人员对硒能否减轻铅诱导损伤产生了浓厚兴趣。虽然一些研究已证明硒对铅毒性的保护作用，但其他研究提示硒在发育过程中不能阻止神经元细胞死亡，使该问题悬而未决。因此，本研究的目的是调查神经元分化过程中低水平铅暴露的影响，并评估硒的潜在保护作用。

**研究方法**
本研究采用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系，通过含1%胎牛血清（FBS）和10 μM视黄酸（RA）的培养基诱导神经元分化。主要关键方法包括：细胞活力测定采用alamarBlue法；乳酸脱氢酶（LDH）释放检测用于评估细胞膜损伤；蛋白质表达分析通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Blotting）进行；细胞内铅含量通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定；基因表达分析采用定量PCR（qPCR）和RNA测序（RNA-seq）；基因敲低通过小干扰RNA（siRNA）转染；基因敲除通过CRISPR-Cas9系统结合慢病毒转导实现，使用人血浆来源（日本红十字东北地区血液中心）。

**研究结果**
**铅诱导分化SH-SY5Y细胞发生伴有膜破坏的细胞死亡**
研究人员发现，在神经元分化过程中，铅暴露以浓度依赖性方式诱导细胞死亡，在30 μM时达到约70%细胞死亡，而未分化细胞未显示毒性。通过增加RA浓度，铅毒性呈剂量依赖性增强，表明分化诱导程度与铅毒性易感性呈正相关。LDH释放与细胞活力降低平行增加，提示铅诱导的细胞死亡伴随质膜破坏，且不同于经典凋亡。此外，铅处理部分抑制了未分化标志物ID1的下调，但ID2未受影响，表明铅可能干扰分化过程。

**铅暴露诱导分化SH-SY5Y细胞发生内质网应激反应**
RNA-seq分析显示，铅处理上调了HSP70家族和未折叠蛋白反应（UPR）相关基因。基因本体富集分析进一步证实了与错误折叠蛋白反应相关的通路显著富集。蛋白质水平上，铅处理显著增加了CHOP和ATF4的表达，且与铅浓度相关。然而，ER应激抑制剂阿佐拉胺（azoramide）未能减轻铅诱导的细胞毒性，表明ER应激并非铅诱导细胞死亡的主要驱动因素。

**硒减轻神经元分化过程中铅诱导的细胞死亡**
细胞死亡抑制剂（Z-VAD-FMK、去铁胺、坏死抑素-1）的评估显示，去铁胺部分保护铅诱导的细胞死亡，但大多数铅毒性不由这些典型细胞死亡形式介导。抗氧化剂中，α-生育酚仅显示适度保护，而亚硒酸盐和硒蛋白P（SeP）有效保护细胞免受铅毒性。ICP-MS分析显示，硒添加对细胞内铅积累影响甚微，说明硒并非通过抑制铅积累起保护作用。硒处理降低了铅诱导的CHOP表达，提示硒至少部分减轻了ER应激反应。

**选择性敲低选定的ER驻留硒蛋白不消除硒的保护作用**
铅与ER示踪剂的部分共定位提示铅可转运至ER。硒处理上调了SELENOK、SELENOS和SELENOT的表达。然而，单独敲低这些基因未消除硒的保护作用，表明在现有实验条件下，这些ER驻留硒蛋白均非单独不可或缺的保护因素。

**硒代谢酶PRDX6对铅诱导细胞死亡的影响**
在PRDX6敲除（KO）细胞中，硒代谢降低导致GPx表达减少。有趣的是，即使在PRDX6 KO细胞中，亚硒酸盐预处理3小时仍保护细胞免受铅诱导死亡，尽管GPx在1-3小时未增加。24小时预处理在PRDX6 KO细胞中显示较弱保护作用，与GPx表达降低一致。GPx模拟物依布硒啉（ebselen）以浓度依赖性方式拯救细胞免受铅毒性，表明过氧化物还原活性至少部分贡献于保护作用。然而，早期保护（6小时内）不能完全由GPx1/4诱导解释，提示其他硒依赖性机制（如快速合成的硒蛋白、硒含低分子量物种或硒依赖性氧化还原修饰）可能参与。

**总结与讨论**
本研究证明，铅诱导的细胞毒性在神经元分化过程中显著增强，并伴随ER应激反应。硒补充剂通过增强细胞应激抵抗而非减少铅积累来减轻细胞毒性。该保护作用部分与过氧化物还原活性相关，但早期保护效应无法通过GPx1/4诱导完全解释，提示存在额外的硒依赖性机制。研究结果揭示了铅诱导神经毒性的分子基础，并支持硒依赖性应激抵抗对铅诱导细胞损伤的保护作用。未来研究需鉴定负责保护作用的特异性硒蛋白及分子机制，探索硒基功能化合物（如依布硒啉）在铅中毒预防和治疗中的潜在应用。

**结论**
本研究使用SH-SY5Y细胞调查了铅在神经分化过程中诱导神经毒性的分子机制，特别关注质膜破坏和ER应激反应。通过亚硒酸盐或SeP补充硒，在不减少细胞铅积累的情况下减轻了铅诱导的细胞毒性。单独敲低SELENOK、SELENOS或SELENOT未消除硒的保护作用，表明在现有实验条件下，这些测试的ER驻留硒蛋白均非单独不可或缺。依布硒啉的保护作用和PRDX6敲除细胞中观察到的后期保护减弱表明，过氧化物还原活性至少部分贡献于硒的保护作用。然而，硒的早期保护效应无法通过可检测的GPx1/4诱导完全解释，提示额外的硒依赖性机制也可能参与。这些发现提供了铅诱导神经分化细胞毒性的新见解，并表明硒可能成为减少铅诱导神经发育损伤的有前景干预措施。