迈向更智能的病毒风险管控：通过活性污泥处理过程中的病毒与污泥质量平衡解析病毒RNA的流失动态

《Water Research》：Towards Smarter Viral Risk Management: Unraveling Viral RNA Loss Dynamics via Virus-in-sludge Mass Balance in Activated Sludge Treatment Process

　　摘要：传统活性污泥法（CAS）和膜生物反应器（MBR）系统在废水处理中能有效去除病毒，从而使处理后的出水病毒浓度降至较低水平。病毒去除效果通常通过对数降低值（LRV）来评估，但该数值反映了多种可控与不可控因素的综合影响，其中包括病毒在活性污泥中的衰减。要准确估算病毒的感染力衰减及RNA损失率，需可靠地量化病毒在固体相中的含量，而病毒主要分布于此，但目前尚无统一的量化方法。本研究探讨了病毒的回收与分布情况，并建立了一种基于污泥的质量平衡模型来估算表观病毒RNA损失量。为提高准确性，研究还采用了针对固体相的高灵敏度RNA量化方法。病毒主要存在于固体组分中，其浓度比进水高出一个数量级以上，表明在污泥停留过程中病毒会不断积累。利用所提出的质量平衡模型，分别估算出PMMoV在CAS系统中的表观病毒RNA损失率为3.23×102/day，在MBR系统中为2.25×101/day；诺如病毒GII在CAS系统中的损失率为1.72×106/day，在MBR系统中为7.16×104/day；爱知病毒在CAS系统中的损失率为3.62×101/day，在MBR系统中为2.18×100/day。这些研究结果凸显了固体相在决定活性污泥处理过程中病毒命运及表观病毒RNA损失方面的关键作用。

引言：基于活性污泥的生物处理工艺，尤其是传统活性污泥法（CAS）系统和膜生物反应器（MBR），被广泛应用于城市污水处理厂。相较于CAS，MBR具有占地面积小、出水水质更稳定的优势。在各类水质参数中，病原微生物尤其是病毒是水回用过程中需要重点去除的物质，因为它们会对公众健康构成威胁。MBR可通过膜分离实现固液分离，同时借助生物作用机制有效去除病毒（Singh等人，2016；Maktabifard等人，2018）。除了用于非饮用水回用领域，如冲厕和洗衣之外，MBR在饮用水回用方面也展现出巨大潜力，有助于提升干旱及人口密集地区的供水安全（Wang等人，2019；Zhang等人，2022a、2022b）。尽管MBR已展现出强大的病原体去除能力，但在现行的饮用水回用法规中，它尚未被正式授予对数降低值（LRV）积分。在加利福尼亚州水资源控制委员会（SWRCB）等机构制定的监管框架中，LRV积分是一种政策工具，用于量化多屏障处理系统中各处理工序的实际病原体去除能力（SWRCB，2019）。这些积分是确保饮用水生产符合微生物风险控制要求的基础。然而，由于目前尚无标准化的方法来评估不同运行条件下MBR的病原体去除性能，监管机构尚未能够为该技术赋予正式的LRV积分。因此，建立科学严谨的评估体系对于将MBR纳入饮用水回用方案、以及为基于证据的监管决策提供支持、从而保障公众健康至关重要。

原始污水中通常含有高浓度的肠道病毒，根据处理效果的不同，其中部分病毒可能会在处理后的废水中依然存在。在各个处理工序前后监测病毒浓度是确定LRV的标准方法（Verbyla等人，2023）。当前的病毒风险管理框架，包括加利福尼亚州的饮用水回用法规，都要求通过各处理环节的LRV之和来实现规定的总LRV值。活性污泥处理既能使病毒失活，也能将其去除，但其实际效果因病毒类型及研究的不同而存在较大差异（Sima等人，2011；Miura等人，2015；Jumat等人，2017；Delank-Pedige等人，2020）。活性污泥系统中病毒的去除依赖于物理和生物机制，比如病毒吸附在絮体上、在MBR中通过膜被截留，以及通过微生物的捕食或降解作用（Chaudhry等人，2015；Wu等人，2022）。进入曝气池的病毒颗粒可能被致密的污泥基质捕获，随后释放到出水中，或在污泥中逐渐衰减（Kim & Unno，1996；Rolland等人，1983；Yang等人，2022；Tchobanoglous等人，2022）。此外，水力停留时间还能缓冲进水中病毒浓度的短期波动，从而使出水中的病毒浓度保持相对稳定且较低水平。

活性污泥系统出水中的病毒浓度受多种因素影响。进水中的病毒可能吸附在污泥生物量上，留在液体相中，或者从污泥絮体上脱落。被吸附的病毒可能随多余的污泥一同被去除，或在污泥中衰减（Glass & O’Brien，2003），也有可能再次释放到处理后的水中。因此，出水中检测到的病毒既来自那些从未被吸附的病毒，也来自在处理过程中从污泥上脱落的病毒。为阐明CAS和MBR处理过程中病毒的命运，采用病毒质量平衡分析方法十分有用。尽管目前只有少数全尺度研究应用了此类分析方法，但Chaudhry等人已经为MBR系统建立了一套完整的质量平衡框架（Chaudhry等人，2015），研究表明，通过进水及回流进入系统的病毒总量，等于排出到出水中的病毒量、随多余污泥被去除的病毒量，以及在液体相和固体相中衰减的病毒量之和。表观病毒RNA损失率——即指在反应池中单位时间内病毒RNA的特定损失量——可以通过质量平衡计算得出，但其准确性在很大程度上取决于病毒量化的可靠性。虽然目前已有使用带负电荷的膜来检测液体相中病毒的方法（Katayama等人，2002），但针对活性污泥固体相中病毒的标准化量化方法尚未建立。较高的固体浓度往往会影响核酸提取、逆转录和qPCR检测的准确性（Kreader，1996；Monopoeho等人，2004；L?nsivaara等人，2025），这可能导致病毒载量被低估。由于病毒会随着污泥的停留时间在固体相中不断积累，其在该相中的含量很可能远远超过进水中的含量。

在COVID-19大流行推动下，废水流行病学研究不断发展，这也促进了病毒量化技术的进步，如今已有更多先进的工具可用于分析活性污泥基质中的病毒。目前已有研究对预处理方法以及DNA/RNA提取技术进行了评估，这些技术包括膜浓缩、沉淀、珠磨法，以及使用额外的裂解缓冲液等方法（Kitamura等人，2021；Torii等人，2022；Zheng等人，2022）。这些进展使得能够更准确地评估病毒在液体相和固体相中的分布情况，进而为质量平衡分析提供更可靠的病毒动态数据。要准确估算病毒RNA的损失量，就必须可靠地量化固体相中的病毒，因为这些病毒的质量标准化含量会显著影响质量平衡的计算结果。活性污泥要么被作为回流污泥重新利用，要么被处置，但在固体停留过程中，这些污泥中可能会积累病毒。如果病毒在污泥中不发生衰减，其吸附效率就会下降，从而导致出水中的病毒载量升高，负责污泥处置的操作人员也会面临较高的病毒暴露风险。因此，了解基于活性污泥的处理过程中病毒的命运，以及病毒在处理过程中的衰减作用，具有非常重要的意义。本研究的目的是为CAS和MBR系统建立病毒质量平衡模型，并通过改进的病毒检测方法——该方法能够考虑病毒在活性污泥液体相和固体相中的分布情况——来估算表观病毒RNA损失率。为此，研究人员从同一座污水处理厂内并行运行的全尺度CAS和MBR处理设施中采集了活性污泥样本。由于这两种系统都在相同的环境条件下处理来自同一水源地的废水，因此可以比较它们各自污泥中的病毒命运，而不会受到进水变化或气候因素的干扰。随后，研究人员利用这些全尺度数据集以及所建立的质量平衡模型，估算出了三种病毒的表观病毒RNA损失率。

样本采集：本研究所分析的污水处理厂采用了两种处理工艺：传统活性污泥法（CAS）系统和膜生物反应器（MBR）系统。从2022年2月到2023年3月，每月从CAS和MBR反应池中各采集两次多余的活性污泥样本（250毫升）和进水样本（1.0升），共采集了27组样本（每个反应池各13组）（详见补充文本1）。

样本预处理：样本预处理的详细步骤见补充文本2。简而言之，研究中对鼠源诺如病毒（MNV）以及……进行了处理。

CAS和MBR系统中的水质参数：为了解析CAS和MBR系统中的废水状况，本研究期间对多项水质参数进行了监测。同时，CAS和MBR系统的进水流量以及CODMn值也被控制在恒定水平（见图S1）。MBR系统中的水温在7月达到最高值，这一现象与日本的季节变化规律一致（见图S1）。在研究期间，反应池中的MLSS值呈波动趋势，从秋季开始逐渐上升（见图S1）。而多余污泥的浓度则没有表现出明显的季节性变化（见图S1）。

来自液体相和固体相的回收效率：我们……

结论：一项重要研究发现是，进水中的废水相关病毒主要存在于活性污泥的固体相中。这一结果强调了量化固体相中病毒含量的重要性，以避免低估活性污泥样本中的病毒载量。通过分析活性污泥处理池中的病毒检测数据以及病毒在活性污泥中的分布情况，我们建立了初步的表观质量平衡模型，并估算出了表观病毒RNA损失量。

CRediT作者贡献声明：Syun-suke Kadoya：概念设计、数据整理、定量分析、可视化、初稿撰写、研究实施、资源获取、实验操作。Tippawan Singhopon：数据整理、研究实施、实验操作。Vu Duc Canh：数据整理、研究实施、实验操作、审稿与编辑。Hiroyuki Katayama：资金筹集、项目监督、审稿与编辑。

未引用参考文献：Adams等人、Zhu等人，2021年；Dekanka-Pedige等人，2020年。

CRediT作者贡献声明：Syun-suke Kadoya：审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法设计、研究实施、数据整理。Tippawan Singhopon：审稿与编辑、研究实施、数据整理。Vu Duc Canh：审稿与编辑、方法设计、研究实施、定量分析、数据整理。Hiroyuki Katayama：审稿与编辑、项目监督、项目管理、资金筹集、概念设计。

利益冲突声明：作者们声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Hiroyuki Katayama表示获得了日本学术振兴会的财政资助，同时还得到了久保田公司的资助。其他作者则声明自己不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢：本研究得到了日本学术振兴会KAKENHI项目20H00259和21J00376的资助，同时也得到了久保田公司的支持。我们还要感谢大阪市公共工程局提供的污水样本。

Syun-suke Kadoya | Tippawan Singhopon | Vu Duc Canh | Hiroyuki Katayama
日本东京都文京区本乡7-3-1，东京大学城市工程系，邮编113-8656