《Cell Regeneration》：Integrated inference of cellular compositions and gene expression programs by deconvolution
编辑推荐：
虽然计算反卷积（computational deconvolution）常规用于从组织混合物中估计细胞类型比例，但在单样本分辨率下重建细胞类型特异性转录组仍是一个基本欠定的算法挑战。因此，现有工具很少能实现准确的单样本基因水平推断。在此，研究人员使用来自多个组
虽然计算反卷积（computational deconvolution）常规用于从组织混合物中估计细胞类型比例，但在单样本分辨率下重建细胞类型特异性转录组仍是一个基本欠定的算法挑战。因此，现有工具很少能实现准确的单样本基因水平推断。在此，研究人员使用来自多个组织的伪批量混合物和真实批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据集，在多种生物学背景下系统地对多种反卷积方法进行了基准测试。评估了这些模型中的关键计算限制后，研究人员开发了BayesPrism-DWLS，这是一个能够在单样本分辨率下整合推断细胞类型比例和细胞类型特异性表达的框架。应用于小鼠结肠批量RNA测序和空间转录组学，BayesPrism-DWLS揭示了在批量或斑点水平无法检测到的细胞类型特异性基因和通路。因此，该框架提供了一个稳健的高分辨率工具，用于解析细胞异质性，并支持利用经济高效的测序数据从细胞类型特异性转录程序出发的机制研究。
论文解读文章
**研究背景与问题**
组织由多种细胞类型构成，每种细胞具有独特的基因表达谱，维持正常生理功能。常规批量RNA测序（bulk RNA-seq）仅能捕获平均表达水平，无法区分细胞类型特异性信号。新兴的空间转录组学技术（如10×Visium）虽保留空间信息，但通常缺乏单细胞分辨率。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和流式细胞术虽能提供高分辨率细胞图谱，但受限于高昂成本、技术变异、高缺失率及可扩展性挑战。计算反卷积（deconvolution）方法成为克服这些局限的有力替代方案，可从混合组织信号中推断细胞类型比例及特异性表达谱。然而，现有方法大多针对血液或免疫富集组织优化，对实体组织的普适性验证不足；且大多数方法在单样本水平准确恢复细胞类型特异性基因表达仍存在根本性挑战。为此，研究人员系统开展了多组织、多方法的基准测试，并开发了整合框架BayesPrism-DWLS。
**研究内容与意义**
研究人员从胃、结肠、小肠、肺和肝脏等组织收集公共scRNA-seq数据集，构建了涵盖25种细胞类型比例反卷积方法和7种基因表达反卷积方法的综合基准测试框架。通过伪批量模拟和真实批量RNA-seq数据验证，发现DWLS（阻尼加权最小二乘）在细胞类型比例估计中表现最优，尤其在低丰度细胞群体中。基于此，研究人员开发了BayesPrism-DWLS，将DWLS估计的比例作为先验输入，指导BayesPrism（贝叶斯细胞比例重建）进行单样本分辨率下的细胞类型特异性基因表达推断。该框架在DSS诱导结肠炎小鼠的批量RNA-seq和10×Visium空间转录组数据中，成功识别出在批量或斑点水平无法检测到的细胞类型特异性差异表达基因和通路，为解析组织异质性和细胞类型特异性机制提供了高分辨率工具。该研究发表在《Cell Regeneration》。
**关键技术方法概述**
研究人员使用了来自胃、结肠、小肠、肺和肝脏的公共scRNA-seq数据集（样本来源包括GEO等数据库），通过随机抽样和聚合构建了1000个伪批量混合物，细胞比例范围1%-95%。采用Pearson相关系数、均方根误差（RMSE）、Bray-Curtis相异度、余弦相似度等指标评估方法性能。对于25种细胞类型比例反卷积方法，包括回归法（OLS、NNLS）、加权最小二乘法（EPIC、EpiDISH）、稳健回归（FARDEEP、RLR）、支持向量回归（CIBERSORT）、惩罚回归（Ridge、Lasso、Elastic Net）、贝叶斯生成模型（BayesPrism、bMIND、CDSeq）以及基于单细胞参考的方法（DWLS、MuSiC、BisqueRNA、SCDC等）。对于7种基因表达反卷积方法，包括CellR、bMIND、swCAM、BayesPrism、TAPE、CDSeq、ENIGMA。开发了BayesPrism-DWLS，以DWLS估计的比例固定输入BayesPrism，解耦比例估计与基因表达推断。在真实数据中，使用免疫荧光染色进行实验验证。
**研究结果**
**Multi-tissue deconvolution benchmarking framework**
通过整合多组织scRNA-seq和bulk RNA-seq数据集，建立了涵盖多种细胞类型（10-17种主要细胞类型）的综合基准测试框架，用于系统评估反卷积方法性能。
**Benchmarking of cell-type deconvolution methods on simulated data**
在胃组织伪批量数据上，DWLS达到最高相关性（Pearson R=0.996）和最低RMSE（0.01），Bray-Curtis相异度最小。在低丰度细胞检测中，DWLS的假阳性率最低（1.3%），假阴性率第二低（1.7%），总体预测准确率最高（98.9%），在0.1%-100%检测阈值下均表现稳健。
**Benchmarking of cell-type deconvolution methods on real bulk data**
在胃上皮ALK3突变小鼠的真实bulk RNA-seq数据中，DWLS预测的细胞比例变化与免疫荧光染色结果高度一致，准确反映了胃底和胃窦的功能差异及ALK3缺失导致的细胞组成变化。在SMAD4敲除小鼠、胃炎症模型、胃肿瘤模型、胃类器官、小肠上皮和肝细胞重编程模型中，DWLS均稳健捕获了符合生物学预期的细胞比例变化，其他方法未能一致恢复方向。
**DWLS-enhanced deconvolution improves cell-type-specific gene expression inference**
在14种胃细胞类型中，BayesPrism-DWLS（以DWLS比例固定输入）的余弦相似度均值从原始BayesPrism的~0.5提升至~0.75，Pearson相关系数超过0.95，低丰度细胞（B细胞、T细胞、簇细胞）也准确恢复。在DSS诱导结肠炎bulk RNA-seq数据中，BayesPrism-DWLS识别的细胞类型特异性差异表达基因（如Ffar4在杯状细胞中上调，Gpx2在干细胞、TA细胞和杯状细胞中下调）与配对scRNA-seq数据一致，其他方法未能捕获。
**Recovery of cell-type-specific gene expression in spatial transcriptomics**
在DSS诱导结肠炎的10×Visium空间转录组数据中，BayesPrism-DWLS估计的细胞空间分布与已知结肠隐窝结构一致。与斑点水平差异表达分析相比，BayesPrism-DWLS在肠上皮细胞中鉴定出更多细胞类型特异性差异表达基因（如Areg），这些基因在斑点水平被掩盖。GO和KEGG富集分析显示，DSS处理后肠上皮细胞上调炎症和应激响应通路，下调吸收和代谢功能。
**Computational efficiency of deconvolution methods**
在25种细胞类型比例反卷积方法中，基于预计算参考矩阵的方法效率更高；在8种基因表达反卷积方法中，BayesPrism-DWLS在较低运行时和内存使用下实现最高准确性，且计算成本随样本量线性增长，具有良好的可扩展性。
**讨论与结论**
讨论部分指出，DWLS通过自适应加权基因、迭代更新约束和阻尼常数，克服了传统最小二乘的偏差，在不同组织中表现稳健。BayesPrism-DWLS在DSS结肠炎模型中揭示了在批量或斑点水平无法检测的细胞类型特异性转录程序，强调了准确比例估计是高质量基因表达反卷积的前提。该框架以开源R包形式提供，仅需单细胞计数矩阵、目标计数矩阵和细胞类型注释三项输入，无需配对样本。局限性包括：依赖外部单细胞参考，细胞类型缺失或错误标注会影响性能；空间转录组分析中基于比例阈值选择斑点可能影响差异表达结果；未整合空间邻域信息。未来可结合图神经网络或Transformer架构，并借鉴scGPT、scFoundation等转录组基础模型。
研究结论：该框架提供了一个稳健的高分辨率工具，用于解析细胞异质性，并支持利用经济高效的测序数据从细胞类型特异性转录程序出发的机制研究。
