抗有丝分裂剂、温度和浸没时间对超甜玉米（Zea mays L. var. saccharata）染色体加倍效率的影响

《Plant Breeding》：Effects of Antimitotic Agents, Temperature and Immersion Time on Chromosome Doubling Efficiency in Supersweet Corn (Zea mays L. var. saccharata)

　　

与常规自交相比，加倍单倍体（DH）技术加速了完全纯合玉米自交系的开发。然而，针对超甜玉米（Zea mays L. var. saccharata）的具体方案，特别是关于抗有丝分裂溶液中的浸没时间和染色体加倍过程中的温度，仍缺乏明确界定。本研究利用一个热带化单倍体诱导系杂交种调查了超甜玉米的单倍体诱导率（HIR），并在一种改良的新萌发种子浸没法中，评估了温度与浸没时间分别在三种抗有丝分裂溶液下对染色体加倍的影响。存活率（SR）在浸没于0°C、17°C和25°C水中的二倍体种子中，以及在17°C下不同浸没时长处理的水（0°C和17°C）、秋水仙素（colchicine）、安磺灵（pronamide）以及甲基胺草磷（APM）与安磺灵组合的溶液中的单倍体种子中进行了评估。将疑似单倍体的染色体加倍效率在新萌发种子处理组之间以及与传统秋水仙素根浸法（RI）之间进行了比较。该热带诱导系杂交种的平均单倍体诱导率为14.6%。温度和暴露时间强烈影响存活率及整体方案的可行性，17°C被确定为最适宜温度，因其能在维持较高存活率的同时允许更长的抗有丝分裂剂暴露时间。在安磺灵中处理10小时以及在甲基胺草磷加安磺灵中处理12小时提高了染色体加倍效率，但导致高死亡率，表明更短的暴露时间更为合适。0°C水处理未改善染色体加倍效率。这些结果表明，在17°C下基于除草剂的新萌发种子浸没法是热带超甜玉米染色体加倍的一种有前景的替代方案。

### 论文解读：超甜玉米染色体加倍效率的影响因素研究

#### 研究背景与问题

超甜玉米（Zea mays L. var. saccharata）因携带sh2或bt2基因突变，导致淀粉合成途径受阻，籽粒在成熟初期呈现甜味，主要作为鲜食或加工产品消费。育种中，加倍单倍体（DH）技术可在两至三代内获得完全纯合自交系，效率远高于常规自交。然而，该技术在超甜玉米中应用不足，尤其是针对单倍体染色体加倍过程中抗有丝分裂剂的浸没时间与温度处理缺乏系统优化。现有方案多基于普通玉米，热带超甜玉米的遗传背景与环境条件差异显著，且常用加倍剂秋水仙素（colchicine）毒性高，亟待开发低毒高效的替代方案。此外，单倍体自发加倍率极低，难以支撑大规模DH系生产，故需明确温度、浸没时间及抗有丝分裂剂组合对加倍效率的协同影响。本研究旨在评估热带诱导系在超甜玉米中的诱导潜力，并优化新萌发种子浸没（GSI）法中的关键参数，以建立适用于热带超甜玉米的染色体加倍方案。

#### 研究内容与结论

研究人员利用国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）开发的CIM2GTAIL-P1与CIM2GTAIL-P2杂交产生的F1诱导系，对8个热带超甜玉米供体群体（PD2004、PD2005、PD2006、SD3001、SD3002、SD3003、SD3005、SD3006，源自隆德里纳州立大学植物育种实验室）进行单倍体诱导，并系统地评估了温度（0°C、17°C、25°C）与浸没时间对不同抗有丝分裂剂（秋水仙素、安磺灵（pronamide）、甲基胺草磷（APM）与安磺灵组合）处理下新萌发种子存活率（SR）和染色体加倍效率的影响。通过三个递进实验（Exp.1、Exp.2、Exp.3），确定了各处理的最适浸没时间，并与传统根浸法（RI）进行对比。结论表明，F1诱导系平均单倍体诱导率（HIR）达14.6%，与温带优良诱导系相当；17°C是维持高存活率并允许较长暴露的最适温度；安磺灵处理10小时及APM+安磺灵处理12小时虽能提高加倍效率，但致死率过高，需缩短时间；0°C水处理未能促进自发加倍。基于除草剂的GSI法在17°C下展现出作为秋水仙素替代方案的潜力，尤其安磺灵处理在整体成功率（OSR2）和籽粒产量上表现优异，部分单倍体穗（DH ears）产籽超过100粒，为热带超甜玉米DH系高效生产提供了新途径。该研究发表于《Plant Breeding》。

#### 关键技术方法（不超过250字）

本研究采用了三个连续实验优化GSI法。实验1（Exp.1）：以二倍体种子为材料，在0°C、17°C、25°C下浸没于水中，时长0–48小时，确定存活率（SR）随温度与时间的变化曲线，以界定可行浸没极限。实验2（Exp.2）：将8个供体群体的5760粒疑似单倍体种子（PHS）分别进行GSI处理，在17°C下测试秋水仙素（0.06%）、安磺灵（6 mg/L）、APM（15 μM）+安磺灵（3 mg/L）及水，在0°C下测试水，时长4–48小时，评估SR及可移植苗率，选定各处理最适浸没时间（以SR≥60%为准）。实验3（Exp.3）：采用6种处理（RI、GSI+水0°C/36 h、GSI+水17°C/12 h、GSI+秋水仙素/12 h、GSI+APM+安磺灵/12 h、GSI+安磺灵/10 h），在8个群体中评估死亡率、弱苗率、存活率、自交率（SPR）、繁殖率（RR）及整体成功率（OSR1、OSR2），并通过D1穗籽粒类别分布间接反映加倍效率（未进行直接倍性分析）。所有实验在隆德里纳州立大学实验农场及温室完成，数据采用方差分析及Scott-Knott检验。

#### 研究结果

**3.1 单倍体诱导**
通过R1-nj基因标记，8个群体平均HIR为14.6%，但假单倍体率达19.5%，修正后真实HIR为11.6%。其中PD2004群体HIR最高（18.7%），SD3006最低（12.2%）。假单倍体率在SD3005中最低（9.2%），PD2004中最高（30.7%），说明R1-nj标记在热带超甜玉米中存在抑制现象，需结合第一叶鞘颜色辅助鉴定。

**3.2 实验1**
二倍体种子在0°C水中浸没48小时，SR仅下降13%；而17°C和25°C下SR分别下降78%和88%，且17°C在10–16小时后SR急剧下降。结果表明低温可延缓厌氧环境导致的死亡，17°C优于25°C。

**3.3 实验2**
单倍体种子在17°C抗有丝分裂剂中浸没，SR在4–8小时保持稳定，12小时后仍>65%，但相同时间下二倍体SR>85%，说明单倍体对浸没更敏感。0°C水处理在32小时内SR>65%。可移植苗率以GSI+水17°C最高（4小时82.96%），GSI+安磺灵最低。基于SR≥60%阈值，选定GSI+水17°C、GSI+APM+安磺灵、GSI+秋水仙素浸没12小时，GSI+安磺灵浸没10小时，GSI+水0°C浸没36小时。

**3.4 实验3**
方差分析显示处理、群体及交互作用显著影响死亡率、可移植苗率、弱苗率及SR。死亡率：GSI+水0°C（30.3%）和GSI+秋水仙素（29.3%）最高，GSI+安磺灵（15.4%）和GSI+APM+安磺灵（15.5%）最低。弱苗率：GSI+安磺灵（21.3%）和GSI+APM+安磺灵（20.9%）最高，GSI+水17°C最低（6.3%），表明抗有丝分裂剂导致形态损伤。可移植V2苗率：GSI+水17°C（67.2%）、GSI+APM+安磺灵（60.1%）和GSI+安磺灵（59.8%）显著高于其他处理。SR：RI处理最高（90.6%），GSI+水17°C次之（59.3%），其余处理约40%。第三周存活率均值93.06%，表明移植后存活良好。自交率（SPR）：RI、GSI+水17°C、GSI+APM+安磺灵和GSI+安磺灵均处于最高组（37.3%–42.1%）。繁殖率（RR）：含抗有丝分裂剂的GSI处理与RI无显著差异，而水处理显著较低，说明化学处理对恢复育性必要。整体成功率1（OSR1）：RI最高（13.25%），GSI+安磺灵次之（8.1%），但RI的OSR2（13.2%）与GSI+安磺灵（17.0%）和GSI+APM+安磺灵（11.8%）无显著差异，表明GSI法在移植后加倍能力与RI相当。SD3003群体在SPR、RR、OSR1和OSR2上表现最优。共获得478个DH穗，GSI+安磺灵处理中20%的穗产籽超过100粒，高于RI的相应比例。

#### 讨论与结论

讨论部分指出，F1诱导系在热带超甜玉米中的HIR略高于其亲本与普通玉米杂交的报道值（5.5%–13.8%），且多数供体群体未出现C1-I等位基因对R1-nj的抑制，便于单倍体鉴定。GSI法结合了浸种与幼苗浸没的优点，采用52小时萌发时程处理年轻组织，增加了处于有丝分裂活跃期的细胞比例，且溶液用量仅为根浸法的1/9。17°C通过抑制厌氧发酵降低死亡率，适合延长浸没时间。实验2中单倍体对浸没的敏感性显著高于二倍体，提示后续研究应使用单倍体材料。实验3中GSI处理在移植后存活率高，但早期死亡率高，需缩短浸没时间或增加初始处理种子数量。安磺灵和APM+安磺灵在OSR2上与RI相当，且安磺灵处理可获得更多高产籽穗，证明其作为秋水仙素替代品的可行性。0°C水处理未能提高自发加倍率，反而因低温胁迫降低育性，不支持使用冷激诱导加倍。

研究结论翻译如下：
研究结果表明，F1诱导系（CIM2GTAIL-P1 × CIM2GTAIL-P2）能有效诱导热带超甜玉米单倍体，诱导率与领先的温带诱导系相当。温度和浸没时间是决定幼苗存活的关键因素，17°C相比25°C可在维持较高存活率的同时允许更长的暴露时间。虽然较长的抗有丝分裂剂浸没时间倾向于提高染色体加倍效率，但也会导致过高的幼苗死亡率，凸显了优化处理时长的重要性。由于染色体加倍效率是通过育性恢复和种子产量间接推断，而非通过直接倍性分析确认，未来有必要开展包含直接倍性测定的研究。重要的是，除草剂安磺灵被证明是秋水仙素的有效且实用的替代品，为改良玉米育种中的染色体加倍方案提供了新机遇。