C117D氧化模拟揭示SARS-CoV-2主蛋白酶的单体结构

《Protein Science》：The C117D oxidation mimic reveals the monomeric structure of SARS-CoV-2 main protease

　　

SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）是病毒复制所必需的，以同源二聚体形式发挥作用，二聚化对催化活性至关重要。Mpro含有异常多的半胱氨酸残基。其中，C117和催化亲核试剂C145在氧化条件下可形成可逆的二硫键。为了研究这些残基不可逆氧化的结构和功能后果，研究人员通过将这两个残基替换为天冬氨酸（C117D和C145D）生成了氧化模拟物，以模拟亚磺酸氧化状态。动力学分析显示，两种变体均无催化活性，其中C117D的活性比野生型（WT）Mpro低至少100倍。小角X射线散射（SAXS）和差示扫描荧光法（DSF）表明，C117D在溶液中呈现单体化、不稳定的状态，而C145D保留了与WT相似的三聚体构象。C117D的晶体学分析揭示了结构域III的显著重排，涉及相对于结构域I和II约40°的旋转，以及N端和C端区域的无序化，破坏了经典的二聚化界面。从C117D位点传播到活性位点的局部结构变化，包括氧阴离子环的解旋，为观察到的失活提供了结构证据。通过形成共价C117D-GC376复合物，能够恢复C117D的稳定二聚体状态。这些发现建立了全长SARS-CoV-2 Mpro单体结构的高分辨率结构，并强调了C117在维持二聚化和酶功能中的关键作用。此外，单体形式中存在的独特单体结构域II-III界面可能为靶向Mpro二聚化的变构抑制剂设计提供机会。

**论文解读：C117D氧化模拟揭示SARS-CoV-2主蛋白酶单体结构及其对二聚化和催化功能的影响**

**研究背景与问题**
SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro，main protease）是病毒复制的关键酶，负责切割病毒多聚蛋白产生功能性非结构蛋白。Mpro以同源二聚体形式存在，二聚化对其催化活性至关重要。Mpro含有异常高比例的半胱氨酸残基（约4%，远高于蛋白质平均的1.3%），其中12个半胱氨酸残基突变率低，提示其在结构-功能关系中具有重要作用。在还原状态下，这些半胱氨酸不形成二硫键；但氧化条件下，部分半胱氨酸可形成过氧亚磺酸、二硫键、氮氧硫（NOS）和硫氧氮氧硫（SONOS）交联。特别值得注意的是，C117与催化亲核试剂C145之间可形成可逆二硫键，并伴随从活性二聚体向非活性单体状态的转变。此前研究通过半胱氨酸-丝氨酸点突变发现，C117S突变使活性降至野生型（WT）的约40%，而C145S完全失活，表明C117对维持功能具有重要作用。然而，C117和C145过度氧化（如亚磺酸状态）对结构和功能的具体影响尚不清楚。为此，研究人员通过构建C117D和C145D突变体模拟亚磺酸氧化状态，旨在阐明过度氧化如何调控Mpro的二聚化、稳定性和催化活性，并为靶向二聚化的变构抑制剂设计提供结构基础。

**主要技术方法**
研究人员采用定点诱变构建C117D和C145D突变体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化。关键方法包括：荧光动力学活性测定（使用DABCYL-KTSAVLQSGFRKM-E(EDANS)底物）评估催化活性；小角X射线散射（SAXS）及尺寸排阻色谱耦合SAXS（SEC-SAXS）分析溶液中的四元状态；差示扫描荧光法（DSF）评估热稳定性；X射线晶体学解析高分辨率结构。所有数据均在野生型（WT）Mpro对照下进行，并利用GC376共价抑制剂研究配体诱导的二聚化恢复。

**研究结果**
**2.1 动力学表征**
通过荧光动力学分析，WT Mpro表现出正常活性，C145D在200倍酶浓度下仍无可检测活性；C117D在相同条件下活性极低，比WT低至少100倍，表明两者均催化失活。

**2.2 SAXS表征**
SEC-SAXS显示，WT和C145D的散射曲线和洗脱峰与已知二聚体溶液状态一致；C117D则呈现明显不同的洗脱曲线，散射数据与单体模型拟合最佳，且无浓度依赖性单体-二聚体平衡。C117D-GC376复合物的SAXS数据表明，GC376结合使C117D从单体转向二聚体状态。

**2.3 稳定性表征**
DSF测定显示，C145D的熔解温度（T_m）为61.5°C，略高于WT的59.5°C；C117D的T_m显著降低至47.9°C，表明其热稳定性大幅下降。与GC376结合后，C117D的T_m升至65.0°C，但仍低于WT-GC376复合物的79.2°C，与SAXS观察到的二聚体恢复一致。

**2.4 晶体学表征**
C145D晶体结构（1.75 ?分辨率）与WT高度相似，Cα-RMSD为0.669 ?，主要差异仅位于活性位点周围环（166-172）和结构域II-III连接区（187-199）。C117D晶体结构（2.05 ?分辨率）显示出巨大变化：与WT相比，Cα-RMSD达11.210 ?；结构域I和II内部变化较小，但结构域III相对于结构域II发生约40°刚性旋转，导致N端前7个残基和C端最后6个残基无序，破坏了经典二聚化界面。活性位点中，氧阴离子环（OA环，残基137-144）呈现“解旋”构象，催化残基C145的硫原子位移约1.5 ?，且电子密度弱，反映无序状态。此外，F140侧链移位约4.9 ?至Y126原本位置，Y126发生约90°旋转，与F140形成新的π-π堆积；Y118、R188、Q189等残基也发生相应位移。这些变化解释了C117D的失活。

**2.5 C117D-GC376复合物结构**
C117D-GC376复合物晶体结构（2.25 ?分辨率）显示，GC376与C145共价结合，整体结构恢复为WT样二聚体构象，Cα-RMSD为0.858 ?，与SAXS和DSF数据一致，表明配体诱导的稳定化使单体重新二聚化。

**讨论与结论**
讨论部分指出，C145D替换主要通过消除活性位点亲核试剂导致失活，但负电荷羧基与H41形成氢键，类似于四面体中间体，反而略微提高热稳定性。C117D替换则通过一个有序-无序转换传播：从C117D位点开始，Y118移位导致区域122-124无序，进而影响N端定位和OA环构象，最终使结构域III旋转，形成单体。该单体中，OA环处于解旋/开放状态，与截短型（1-199）Mpro的开放状态相似，但通过与重定位的结构域III中D289/E290的相互作用部分稳定。GC376结合能够稳定OA环的闭合构象，从而恢复二聚体。与C117-C145二硫键诱导的单体相比，C117D单体更稳定，更偏向单体端，但两者共享全局结构特征（如域III旋转和OA环无序）。因此，C117D结构为氧化诱导的单体状态提供了准确模型，并揭示了C117、活性位点、N端和OA环之间的变构耦合。

**结论部分翻译**
多项研究强调了SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）序列中异常的半胱氨酸含量，并提出了围绕这些半胱氨酸残基功能重要性的多种机制，以及它们在感染周期中抵抗活性氧（ROS）产生的潜在作用。本研究呈现了关于先前观察到的活性位点C145亲核试剂与C117之间形成可逆二硫键的两个残基的氧化模拟数据。这些数据表明，防止C117氧化至关重要，因为氧化会导致C117局部区域发生有序-无序转换，进而引发结构变化，使酶进入不稳定的单体状态。全长酶单体形式的结构表征进一步阐明了二聚体形式与OA环稳定化之间的联系，后者通过二聚化增强活性。最后，单体状态下结构域II和III之间独特的定位和新界面的产生，为开发以小分子变构方式稳定该独特单体构象的药物提供了机会，从而通过改变单体-二聚体平衡作为Mpro抑制的潜在机制。