《Veterinary Medicine and Science》：Beraprost Attenuates Starvation-Induced Apoptosis and Protects Feline Endothelial Cells
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摘要
**目的**：本研究旨在建立猫内皮细胞（FECs）在多种营养剥夺（饥饿）条件下发生凋亡的体外模型，以探讨贝前列素及其立体异构体对内皮细胞的保护作用。
**方法**：研究人员测试了多种饥饿条件，通过检测caspase-3/7活性来诱导永生化猫主动脉内皮
摘要
**目的**：本研究旨在建立猫内皮细胞（FECs）在多种营养剥夺（饥饿）条件下发生凋亡的体外模型，以探讨贝前列素及其立体异构体对内皮细胞的保护作用。
**方法**：研究人员测试了多种饥饿条件，通过检测caspase-3/7活性来诱导永生化猫主动脉内皮细胞发生凋亡。通过测定caspase-3/7活性和Bax/Bcl2基因表达，并进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测，确定了贝前列素外消旋混合物及其所含立体异构体贝前列素-314d和贝前列素-315d的抗凋亡效应。
**结果**：饥饿显著增加了FECs中caspase-3/7的活性并诱导细胞凋亡。贝前列素和贝前列素-314d以剂量依赖性方式有效抑制caspase-3/7的激活，而贝前列素-315d的效力较低。贝前列素下调Bax表达并减少TUNEL阳性细胞数量，证实了其抗凋亡作用。
**结论与相关性**：贝前列素可有效减轻培养的永生化猫主动脉内皮细胞中饥饿诱导的凋亡相关事件，抑制caspase-3/7活性并调节Bax表达。这些发现提示了一种可能有助于解释贝前列素在猫慢性肾病（CKD）中临床疗效的潜在机制假说，但尚需使用肾内皮细胞和体内模型进行进一步验证。
贝前列素对猫内皮细胞饥饿诱导凋亡的保护作用研究解读
**一、研究背景与科学问题**
血管内皮细胞衰老与凋亡及其导致的毛细血管稀疏化——即微血管网络密度降低——是年龄相关性肾脏疾病的重要病理学特征。在患有慢性肾病（chronic kidney disease, CKD）的猫中，通过定量免疫组织化学检测发现，受影响肾脏中的毛细血管稀疏化程度与肾功能障碍呈正相关。临床数据显示，通过保护肾内皮和毛细血管网络功能来减缓肾功能丧失，可能延长CKD患猫的寿命。
贝前列素是一种化学性质稳定的合成前列环素类似物，口服给药后具有高活性和长效性。既往临床研究提示贝前列素治疗与猫CKD患者血清肌酐水平变化存在关联，但其对总体生存率和肾内皮保护的直接效应尚未完全阐明。近期Ito等人（2023）报道贝前列素治疗与改善猫CKD总体生存率显著相关。贝前列素是一种外消旋混合物，由两对立体异构体——贝前列素-314d和贝前列素-315d——及其对映体以1:1:1:1的总摩尔比组成。已发表数据表明贝前列素的不同异构体具有不同的药理学效力，但这些效应是否具有物种和/或细胞类型特异性，以及它们会在猫内皮细胞（FECs）中诱导何种效应，目前尚不清楚。
本研究旨在利用多种营养饥饿条件建立体外FECs凋亡模型，并探讨贝前列素外消旋混合物及其异构体（-314d和-315d）如何对FECs提供保护性抗凋亡效应。此外，本研究还旨在确定贝前列素在FECs中诱导保护性（抗凋亡）效应所需的最低有效剂量。
**二、研究内容与主要技术方法**
研究人员利用永生化猫主动脉内皮细胞系（由健康猫主动脉来源并经SV40大T抗原和端粒酶逆转录酶催化亚基永生化处理），首先测试了六种含不同浓度胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（0.5%、0.1%或0%），并分别添加或不添加50 μg/mL内皮细胞生长补充物（endothelial cell growth supplement, ECGS）的饥饿培养基，通过检测caspase-3/7活性确定最佳凋亡诱导条件。随后，研究人员在选定饥饿条件下，用不同浓度的贝前列素外消旋混合物、贝前列素-314d和贝前列素-315d处理细胞，检测caspase-3/7活性、Bax/Bcl2基因表达水平，并通过TUNEL染色检测DNA片段化。所有实验均进行三次生物学重复，采用单因素方差分析和Dunnett检验或Holm–Bonferroni检验进行统计分析。
**三、研究结果**
**3.1 饥饿条件诱导FECs凋亡相关事件的建立**
研究人员通过检测不同FBS浓度（有无ECGS补充）条件下FECs的caspase-3/7活性，发现随着FBS/ECGS的减少或去除，caspase-3/7活性呈明显激活趋势，平均活性范围为完全培养基对照组的134.2%至215.1%。基于这些结果，选择0.1% FBS且不含ECGS作为后续药理实验的最佳饥饿条件。这一含0.1%血清的条件被选中，以避免完全无血清条件下可能破坏内源性前列环素功能的风险。
**3.2 贝前列素及其异构体对FECs中caspase-3/7活性的抑制作用**
饥饿诱导的caspase-3/7激活可被贝前列素或贝前列素-314d在0.5 nM或更高浓度下显著抑制。在贝前列素-315d组中，仅在5 nM浓度下观察到抑制效应（p < 0.025）。贝前列素组的caspase-3/7活性水平与贝前列素-314d组几乎相同，而贝前列素-315d组的活性水平显著更高。这表明贝前列素-314d的药理效力与贝前列素外消旋混合物相当，而贝前列素-315d的效力较低。
**3.3 贝前列素处理后饥饿FECs中Bax/Bcl2的表达**
饥饿条件下FECs中促凋亡基因Bax的相对表达量与贝前列素浓度呈反比关系。与未处理组相比，贝前列素在1.0 nM或更高浓度下显著下调饥饿FECs中Bax的表达（p < 0.05）。即使在较高浓度下，贝前列素或其异构体处理也未引起抗凋亡基因Bcl2表达的显著变化。这表明贝前列素的抗凋亡效应主要通过下调促凋亡因子Bax实现，而非上调抗凋亡因子Bcl2。
**3.4 TUNEL检测饥饿FECs中DNA片段化**
未接受贝前列素处理的饥饿FECs中，TUNEL阳性细胞核的比例证实了凋亡相关的DNA片段化。与未处理的饥饿FECs相比，贝前列素处理显著减少了TUNEL阳性凋亡细胞的数量。在低至0.1 nM的浓度下，TUNEL阳性细胞数量即显著减少（p < 0.01）；但在贝前列素浓度高于1.0 nM时，TUNEL阳性细胞的进一步减少未再实现。
**四、讨论与结论**
本研究建立了评价贝前列素及其立体异构体在饥饿条件下对FECs药理效应的体外模型。研究结果表明，贝前列素外消旋混合物及其异构体贝前列素-314d比贝前列素-315d具有更好的caspase抑制效力。TUNEL染色检测证实了贝前列素在该FEC模型中的抗凋亡效应，Bax相对表达量的定量分析揭示了贝前列素处理所致的剂量依赖性下调。
既往比较研究显示，贝前列素-314d与贝前列素在大鼠肺动脉内皮介导的NO产生相关的血管舒张方面EC50相似，但在人肺动脉平滑肌细胞cAMP升高的EC50方面，贝前列素-314d比贝前列素低4.6倍。然而，在人类医学中，口服贝前列素-314d联合吸入曲前列环素的三期临床试验未能达到统计学显著性。本研究结果与既往在鼠肺动脉中描述的内皮源性NO产生效应一致，提示对映体分离未必能在改善猫CKD患者临床疗效方面提供实质性优势。
关于贝前列素诱导抗凋亡效应的具体机制，既往研究表明贝前列素可通过蛋白激酶A和环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）信号通路刺激前列环素信号传导和一氧化氮（nitric oxide, NO）产生。前列环素从内皮释放，与内皮细胞的细胞受体和核受体结合，作为自分泌因子调节细胞存活。CKD常见于老年猫，内皮细胞衰老导致NO合成减少而增强凋亡诱导，可能形成恶性循环。研究人员假设贝前列素对凋亡相关事件的减轻可能代表保护猫CKD肾脏毛细血管网络的潜在机制。
本研究存在若干局限性。体外饥饿模型不能完全重现猫CKD肾脏的复杂微环境。虽然使用了多种互补方法评估细胞死亡，但仍不能完全排除严重饥饿应激引起的其他细胞死亡形式或DNA损伤。研究人员指出当前发现应视为初步结果，需要进一步开展体内研究及利用原代猫肾内皮细胞进行实验，以验证这些发现对猫CKD的直接临床相关性。
**结论**：细胞培养基中的营养剥夺可诱导FECs中caspase-3/7活性增加并促进凋亡相关事件发生。贝前列素以剂量依赖性方式抑制caspase-3/7激活。异构体贝前列素-314d的最低有效剂量与贝前列素一致，而异构体贝前列素-315d的最低有效剂量较高。贝前列素即使在低浓度下也能抑制caspase-3/7活性、下调Bax表达并抑制FECs死亡。
