从腹泻犊牛中分离的大肠杆菌潜在疫苗株的鉴定

《Veterinary Medicine and Science》：Identification of Potential Vaccine Strains of Escherichia coli Isolates From Diarrhoeic Calves

　　

摘要
背景：大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）是2月龄以下犊牛腹泻病例中最常分离的细菌。
目的：本研究旨在通过抗原谱分析和基因分型，对腹泻犊牛分离株进行鉴定，以识别具有免疫原性潜力的E. coli菌株。
方法：研究人员对从500份粪便样本中分离的E. coli菌株进行了表型和基因型抗生素耐药性特征及毒力基因的检测，其中88株进一步采用多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis，MLVA）方法进行基因分型。随后，根据抗生素耐药模式和基因分型（MLVA）结果，选取20株E. coli菌株，并对其外膜囊泡（outer membrane vesicle，OMV）图谱进行分析。
结果：在这些菌株中，Ec048和Ec026菌株表现出高OMV多样性，被确定为有前景的候选菌株，可用于进一步的免疫原性评估。用这些菌株免疫实验动物增强了体液免疫应答（免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、分化簇20（CD20）），而细胞免疫参数（分化簇4（CD4）、分化簇8（CD8））未显示显著变化。
结论：总之，该研究表明Ec048和Ec026菌株能引发强烈的体液免疫应答，表明它们具有疫苗开发的潜力。然而，研究未评估保护效力，需要进一步开展包括攻毒实验在内的研究，以确认其作为疫苗菌株的适用性。

论文解读

**研究背景与问题**
犊牛腹泻是全球畜牧业中常见的健康问题，严重影响犊牛存活率，造成重大经济损失。在2月龄以下犊牛的腹泻病例中，大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）是最常分离的病原菌。根据不同致病机制，E. coli可分为多种致病变种，如产肠毒素性大肠杆菌（enterotoxigenic E. coli，ETEC）、肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic E. coli，EPEC）等。其致病性依赖于多种毒力因子，包括黏附素（如菌毛、非菌毛黏附素）、毒素（如志贺毒素、细胞毒性坏死因子）、气杆菌素及外膜蛋白等。随着抗生素耐药性的日益严峻，疾病预防策略（如疫苗接种）在控制感染中愈发重要。然而，现有针对犊牛腹泻的商品化疫苗在田间试验中常缺乏有效性，主要原因是流行菌株与疫苗株之间存在显著差异。此外，不同地理区域流行的E. coli菌株多样性高，亟需开发针对特定区域流行株的疫苗或高免血清。本研究基于土耳其东部安纳托利亚地区（主要养牛区）的腹泻犊牛样本，旨在分离E. coli并鉴定其毒力特征、抗生素耐药性、外膜囊泡（outer membrane vesicle，OMV）图谱及遗传关系，从而筛选具有免疫原性潜力的菌株，为后续实验免疫研究提供候选。

**研究方法**
研究人员从土耳其东部安纳托利亚地区的9个省份（埃尔祖鲁姆、埃尔津詹、卡尔斯、阿勒、阿尔达汉、巴伊布尔特、阿尔特温、居米什哈内、厄德尔）的约500份腹泻犊牛粪便样本中分离E. coli，样本采集按各地牛群密度比例分配。关键技术方法包括：采用纸片扩散法进行表型抗菌药物敏感性试验，并检测相应耐药基因（如aadA、tetA、blaTEM等）；通过PCR检测毒力基因（如stx1、stx2、fimH、traT等）；对88株多重耐药且携带较多毒力因子的菌株采用多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis，MLVA）进行基因分型；基于MLVA结果，从两大主要基因群中选取20株菌株，提取其OMV并进行SDS-PAGE蛋白图谱分析；最终基于OMV多样性、毒力基因和耐药谱，选择两株菌株（Ec048和Ec026），以甲醛灭活后辅以铝佐剂，通过皮下注射免疫BALB/c小鼠（分为三个剂量组：1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹），并在第0、21、42天采血，通过流式细胞术检测免疫参数（CD4、CD8、CD19、CD20、CD45、IgG、IgM、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α）。

**研究结果**

**3.1 样本采集与细菌培养**
共采集500份粪便样本，经培养鉴定，53.6%（268/500）的样本分离出E. coli。

**3.2 抗菌药物敏感性试验与耐药基因分析**
纸片扩散法显示，268株E. coli分离株对多种抗生素呈现不同耐药率，其中对土霉素（88.3%）、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（68.3%）耐药率最高。耐药基因检测显示，floR（68.8%）、aadA（58.2%）、dhfrI（56.5%）等基因检出率较高。表型与基因型耐药的一致性分析显示，部分菌株存在不一致现象（如32.1%的菌株对阿莫西林/克拉维酸表型与基因型不符）。

**3.3 E. coli毒力基因的确定**
PCR检测显示，毒力基因fimH（94.8%）、traT（87.3%）和ompT（69.4%）检出率最高，其次为phoA（51.9%）、cs31A（38.4%）、cnf1（44.8%）等，志贺毒素基因stx1（8.6%）和stx2（19.4%）也有检出。

**3.4 MLVA分析**
对88株E. coli进行MLVA基因分型，共鉴定出32个克隆群（相似度10%），揭示了菌株间的遗传多样性。

**3.5 OMV分析**
从MLVA两大主要基因群中选取20株菌株进行OMV蛋白图谱分析，结果发现菌株Ec048和Ec026的OMV多样性最高，且携带有K99菌毛等毒力因子，因此被选用于后续免疫实验。

**3.6 实验动物免疫与流式细胞术分析**
流式细胞术检测显示，免疫后各组（除阴性对照组外）的CD45、TNF-α、IgM、CD20、IFN-γ、CD19、IgG和IL-4水平均显著升高（p<0.05），且随时间（第0、21、42天）呈逐渐增加趋势。其中，剂量1×10¹¹组（尤其Ec026和Ec048）诱导的免疫应答最为强烈，1×10¹⁰组应答可接受，而1×10⁹组未能引发充分应答。细胞免疫参数CD4和CD8在各组间无显著变化（p>0.05），表明主要诱导了体液免疫应答。IL-10水平仅检测到组与时间的交互作用显著（p=0.038），但组别和时间主效应不显著。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究中E. coli的分离率（53.6%）与文献报道（43.5%–100%）一致，差异可能与地理区域、年份及采样时是否处于治疗阶段有关。毒力因子分析结果与先前研究相似，fimH、traT等黏附相关基因及毒素基因的存在与犊牛腹泻病因相关。抗生素耐药性方面，表型与基因型不完全一致，部分菌株虽携带耐药基因但表型敏感，可能由于缺乏整合子启动子表达；而表型耐药但未检测到相应基因，则提示新耐药因子的潜在出现。MLVA基因分型优于脉冲场凝胶电泳（PFGE），能有效区分爆发菌株，本研究识别出32个克隆群，展示了菌株的遗传异质性。OMV分析筛选出高多样性的Ec048和Ec026菌株。免疫实验结果显示，铝佐剂灭活菌株诱导了强烈的体液免疫应答（IgG、IgM、CD20升高），伴随IL-4升高和IL-10相对降低，符合Th2型免疫反应特征，但未激活细胞免疫（CD4/CD8无变化）。CD45水平升高表明T、B淋巴细胞被激活。研究局限性包括未设置阳性对照组（因无适合的本地标准疫苗株）以及未进行攻毒实验评估保护效力。结论认为，Ec026和Ec048菌株具有免疫原性潜力，可作为控制犊牛腹泻的候选疫苗株，但需在靶动物（新生犊牛）中开展进一步田野试验、母源免疫评估及攻毒实验以确认其保护效力。论文发表在《Veterinary Medicine and Science》。

**研究结论翻译**
总之，从研究区域中普遍分离到的Ec026和Ec048大肠杆菌（E. coli）菌株，其毒力特征和抗菌药物敏感性谱支持将其视为具有免疫原性潜力的菌株，可在控制犊牛腹泻的研究中进一步评估。在目标动物群体中对这两株菌株进行田野试验，并与商品化疫苗进行比较，将有助于推广本研究的发现。未来需要在新生犊牛中开展研究，包括母源免疫评估和攻毒实验，以确认所选菌株的保护潜力。