肾细胞癌免疫治疗反应的预测性生物标志物：为何未能发挥作用？

《Current Opinion in Urology》：Predictive biomarkers for immunotherapy response in renal cell carcinoma: why have they failed?

　　综述目的：肾细胞癌对免疫疗法的反应存在差异性，这迫切需要预测性生物标志物来指导治疗决策。然而，目前临床实践中尚未采用任何可靠的预测性生物标志物。本综述旨在概述在开发一致预测性生物标志物方面的现有局限性。

最新研究进展：目前的生物标志物，包括程序性细胞死亡1配体1表达、肿瘤突变负荷、血液生物标志物以及组织病理学和分子特征，主要具有预后价值而非预测价值。肿瘤的空间和时间异质性、方法学局限性以及试验设计约束逐渐被认定为阻碍该领域进展的关键因素。此外，联合疗法进一步增加了生物标志物解读的复杂性。为更准确反映肾细胞癌的复杂性和动态特性，生物标志物研究越来越多地采用多组学方法、纵向评估以及人工智能驱动的复合模型。

总结：由于生物学复杂性、方法学和试验设计局限性以及缺乏充分验证，目前仍未能在临床实践中建立有效的预测性生物标志物。单一生物标志物无法全面反映肿瘤的空间和时间异质性以及联合疗法的影响。未来的研究需要采用以生物标志物为分层的前瞻性试验设计，设定明确的终点指标，并进行严格的外部验证，才能确立具有临床意义的生物标志物。

关键点：对于未经治疗的转移性肾细胞癌患者，尽管不同治疗方案在作用机制、毒性特征以及缓解患者比例方面存在显著差异，但目前仍无法通过生物标志物来选择双免疫检查点抑制剂联合使用方案或免疫检查点抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂联合使用方案。程序性细胞死亡1配体1表达、肿瘤突变负荷、血液生物标志物以及组织病理学和分子特征虽在肾细胞癌中具有预后意义，但作为免疫检查点抑制剂反应预测标志物的作用并不牢固。单一生物标志物无法预测治疗反应，这可能与肿瘤的空间和时间异质性、检测方法和评分标准的差异、以回顾性研究为主的证据基础以及疾病的生物学复杂性有关。多组学方法、人工智能驱动的复合生物标志物以及以生物标志物为中心的试验设计——这些都在数据共享联盟、平台试验计划以及检测标准化等现有研究中得到体现——代表了通往具有临床应用价值的生物标志物的最可行路径。

引言：免疫检查点抑制剂的引入彻底改变了肾细胞癌的系统性治疗方式，无论是在转移性疾病治疗还是辅助治疗中都发挥了重要作用[1]。基于免疫检查点抑制剂的联合疗法，包括双免疫检查点抑制剂疗法以及与酪氨酸激酶抑制剂的联合疗法，已成为转移性肾细胞癌的一线标准治疗方案[2]；而帕博利珠单抗作为辅助疗法，已被证明能提高术后复发风险较高的患者的总生存期[3]。尽管采用了分子靶向疗法，治疗决策仍主要依赖于传统的临床指标[2]。鉴于患者个体间治疗反应的巨大差异以及相应的不良事件发生率，亟需更为可靠的预测策略。虽然有多种生物标志物被认为具有预测价值，但许多实际上仅具有预后意义，因此无法用于区分哪些患者能从某种疗法中获益[4]。经过多年深入研究，至今仍未确立任何经验证的预测性生物标志物或标志物组合，以指导肾细胞癌的治疗决策，尤其是在免疫检查点抑制剂治疗方面[5]。在未经治疗的转移性肾细胞癌患者中，这一问题尤为突出，目前仍无法通过生物标志物来选择合适的联合治疗方案[2,5]。由于不同治疗方案在作用机制、毒性特征以及缓解患者比例方面存在差异，这种不确定性会带来相当大的后果。因此，由于缺乏预测性生物标志物，许多患者可能不得不接受效果不佳的治疗。本文旨在分析其背后的原因，并探讨未来研究的潜在方向。

肾细胞癌中的当前生物标志物：迄今为止，已有四类主要生物标志物被研究作为预测性标志物，具体如下：

程序性细胞死亡1配体1表达：程序性细胞死亡1（PD-1）/程序性细胞死亡1配体1（PD-L1）轴是免疫检查点介导的免疫调节的典型代表[6]。多种癌症类型的肿瘤细胞都会利用PD-L1表达来逃避免疫系统的攻击[6]。基于这一原理，人们研发出了能够阻断PD-1/PD-L1轴的抗体，从而释放自然免疫反应的潜力，提高患者生存率，这类抗体也因此成为肾细胞癌系统性治疗的常规手段[2]。然而，关于PD-L1表达对免疫检查点抑制剂治疗反应的预测价值的研究结果并不一致[5]。有些研究显示，PD-L1阳性的患者在接受免疫检查点抑制剂治疗后预后更好，而另一些研究则未发现显著关联[5]。这可能源于不同的PD-L1检测方法、不同的评分标准以及各试验设定的阳性阈值不同。不过，也有可能尽管存在合理的生物学机制，PD-L1仅具有预后意义，而非预测意义，就像在尿路上皮癌中所观察到的那样[5,7]。正因如此，目前尚未将PD-L1表达水平用于指导治疗决策。

肿瘤突变负荷：肿瘤突变负荷是指肿瘤基因组中的体细胞突变总数[8]。由于较高的肿瘤突变负荷会增加新抗原的表达，从而可能增强免疫系统对肿瘤细胞的识别能力[8]，因此较高突变负荷可被用来预测多种癌症对免疫疗法的反应[8]。在肾细胞癌中，肿瘤突变负荷的预测价值较为有限[5]。例如，在JAVELIN Renal 101试验（阿维鲁单抗加阿昔替尼对比舒尼替尼用于晚期肾细胞癌治疗）中，肿瘤突变负荷与无进展生存期之间并未发现一致的关联；在CheckMate 214试验（纳武利尤单抗加伊匹木单抗对比舒尼替尼用于晚期肾细胞癌治疗）中，肿瘤突变负荷也与免疫检查点抑制剂治疗后的无进展生存期或总生存期无关[9,10]。这部分是因为肾细胞癌的肿瘤突变负荷相对较低，低于其他类型的肿瘤[5]。

血液生物标志物：血液生物标志物包括炎症标志物、循环核酸以及其它血浆分析物，如蛋白质和代谢物。中性粒细胞与淋巴细胞比值、血小板与淋巴细胞比值以及C反应蛋白等炎症标志物是常用的检测指标，它们易于获取，且在肾细胞癌中具有显著的预后价值[5,11]。尽管也有人研究过这些标志物作为免疫检查点抑制剂治疗反应预测标志物的可能性，但结果尚无定论，部分原因是相关研究多为回顾性研究，存在选择偏差，难以得出确切的因果关系，也可能是一些标志物的区分能力有限[11]。近年来，人们一直在努力阐明循环核酸在肾细胞癌中的预测作用[12]。这类核酸在液体活检应用方面展现出巨大潜力，有望用于治疗监测[12]。不过，目前尚无任何基于液体活检的检测方法被批准用于肾细胞癌诊断，且核酸也并非常规用于治疗分层[12]。液体活检方法还存在其他局限性，如研究样本量较小、验证和标准化程度不足等[12]。此外，肾细胞癌与其他癌症在生物学上的差异也限制了现有循环肿瘤细胞检测方法的通用性[12]。虽然液体活检方法越来越受到关注，但提升其敏感性、特异性和标准化水平仍是当务之急。

组织病理学和分子特征：在手术或活检获取组织后，可以评估多种组织病理学特征，包括肿瘤分级、肾细胞癌亚型、淋巴血管侵犯以及肿瘤坏死程度[2]。这些特征的预后价值已得到充分证实，但作为预测性生物标志物的作用仍然有限，目前仅用于帕博利珠单抗辅助治疗时的风险分层，而非用于转移性肾细胞癌中免疫检查点抑制剂的选用[2]。具有肉瘤样分化的肿瘤属于去分化类型，这类肿瘤往往恶性程度更高，但同时也有更高的免疫检查点抑制剂反应率[5]。由于缺乏更多的前瞻性研究、统一的评估标准以及明确的临界值定义，肉瘤样特征难以被用作预测性生物标志物[2]。此外，尽管某些特定基因突变（如影响VHL、PBRM1、BAP1、SETD2基因的突变）与肾细胞癌的生存预后相关，但其预测价值并不稳定[5]。总之，目前所研究的多数肾细胞癌生物标志物都具有预后意义，但无法帮助我们实现更个性化的治疗选择。表1总结了各类当前生物标志物的预后价值、预测价值、证据等级以及目前的临床应用情况及其主要局限性。

表1 肾细胞癌中当前生物标志物的概况

| 生物标志物 | 预后价值 | 预测价值 | 预测价值证据等级 | 目前临床应用情况 | 主要局限性 |
|----------|----------|----------|------------------|------------------|------------|
| PD-L1 | 不一致 | 冲突结果 | 有限 | 未用于临床决策 | 肿瘤空间异质性、检测方法不同、评分标准不一致、各试验设定的阳性阈值不同[5,14] |
| 肿瘤突变负荷 | 不足 | 有限 | 不充分 | 未用于临床决策 | 肾细胞癌的肿瘤突变负荷较低[5,9,10] |
| 血液生物标志物（含液体活检） | 已有明确预后价值 | 整体结论尚不确定，但在液体活检领域前景较好 | 有限 | 未用于临床决策 | 研究多为回顾性、样本量小、验证和标准化不足[5,11,12] |
| 组织病理学/分子特征 | 预后价值已明确 | 预测价值有限 | 有限 | 仅可用于指导治疗选择，但应用受限 | 需要组织取样、缺乏前瞻性研究、缺乏统一的评估标准和临界值定义、肿瘤存在空间异质性[2,5,10] |

其中，“预测价值证据等级”分为强、中、有限或不足四个级别。PD-L1即程序性细胞死亡1配体1；RCC即肾细胞癌；TMB即肿瘤突变负荷。

为何生物标志物在肾细胞癌中失效？尽管各种生物标志物本身存在一定的局限性，但还有几类普遍存在的因素持续制约着它们的预测性能，以下是这些关键因素：

肿瘤异质性：肿瘤异质性是建立可靠肾细胞癌生物标志物的主要障碍之一。肿瘤内的某些分子和细胞特征，如受体表达情况或肿瘤微环境中的成分，并非在肿瘤的所有区域以及原发肿瘤与转移灶之间都保持一致（即存在肿瘤内异质性和肿瘤间异质性）。肿瘤异质性反映了肿瘤细胞的克隆进化过程，这些细胞会不断积累新的突变，进而形成具有不同生物学特性的亚群[13]。据认为，转移灶源自原发肿瘤内的一个或多个亚克隆[13]。通过基因测序，可在同一个肿瘤中发现预示良好预后和不良预后的基因表达特征，以及不同肿瘤抑制基因的突变差异[13]。有些突变仅存在于转移灶中[13]。肿瘤异质性还会影响PD-L1表达等具有临床意义的生物标志物，据报道，原发肿瘤与转移灶之间的PD-L1表达一致性仅为约20%[14]。这就降低了仅通过一次活检获得的生物标志物的预测价值，因为由于采样偏差，单个样本可能无法充分代表整个肿瘤的情况[13]。

动态的肿瘤微环境：除了空间上的异质性外，肿瘤微环境的时间动态变化也增加了建立经过临床验证的生物标志物的难度。肿瘤微环境由细胞、细胞外基质以及细胞因子、生长因子和代谢物等可溶性因子共同构成[15]。在肿瘤生长过程中，肿瘤微环境的各个组成部分会通过相互作用而发生改变[15]。在疾病早期，具有细胞毒作用的免疫细胞能够控制肿瘤生长，但在疾病晚期，肿瘤细胞会发展出逃避宿主免疫系统的机制[15]。抗肿瘤免疫既会通过免疫检查点信号通路直接受到抑制，也会因肿瘤细胞产生的免疫抑制性细胞因子以及代谢限制而间接受到抑制[15]。免疫检查点抑制剂能够调控肿瘤微环境，使其保持动态变化[15]。因此，与肿瘤微环境相关的生物标志物也会发生动态变化，其预测和预后价值并非固定不变，可能会根据检测时间点出现较大差异。在此背景下研究最为深入的生物标志物之一PD-L1的表达，就受到炎症细胞因子、非编码RNA以及翻译后修饰等多种因素的影响[16]。有研究显示，在胃食管腺癌中，化疗前后原发肿瘤的PD-L1状态在时间上的一致性为63%[17]。在透明细胞肾细胞癌的成对肿瘤样本中，也观察到了酪氨酸激酶抑制剂治疗会导致肿瘤浸润淋巴细胞发生结构重塑[18]。综合这些研究结果表明，仅在某个时间点检测生物标志物，可能会无法准确反映其实际的时间动态变化。

方法学和技术局限性：方法学和技术层面的问题也是生物标志物研究中的常见局限性。在分析前的阶段、分析阶段或分析后的阶段都可能存在潜在的偏差。分析前的局限性包括肿瘤异质性和采样偏差[5]。在分析阶段，检测方法的验证不足、检测结果的差异性以及不同试验所使用的试剂、抗体等参数的不同，都会影响不同研究结果之间的可比性[5,19]。对于单一基因生物标志物的评估，尤其缺乏标准化的试验设计[5]。分析后的阶段则存在临界值定义不统一、过多采用事后分析以及缺乏外部验证等问题[5,19]。此外，样本量较小的研究结果可能存在高估风险，还可能导致过度拟合现象[19]。另外，人们也对循环肿瘤DNA的水平能否真实反映肿瘤细胞存在疑问，因为肿瘤组织与循环肿瘤DNA之间的基因组变异一致性很低，仅为8.6%[20]。理想的预测性生物标志物应通过在随机临床试验中得到验证，因为其核心价值就在于能够证明其对治疗结果有影响[4]。这些局限性为生物标志物的开发带来了巨大挑战。

联合疗法带来的挑战：随着联合疗法在肾细胞癌治疗中的日益广泛应用，情况变得更加复杂。需要预测性生物标志物来区分哪些患者可以从双免疫检查点抑制剂联合使用方案中获益，哪些患者可以从免疫检查点抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂联合使用方案中受益。联合疗法针对的是不同的、可能相互作用的途径，如免疫激活和血管生成[2]。目前所知的生物标志物甚至无法一致地预测单一疗法的疗效[5]。这就引出了一个核心问题：在联合疗法中，它们应该预测什么——免疫反应、靶向疗法的反应，还是二者之间的相互作用？例如，JAVELIN Renal 101试验（阿维鲁单抗加阿昔替尼对比舒尼替尼）和CheckMate 214试验（纳武利尤单抗加伊匹单抗对比舒尼替尼）的生物标志物分析表明，与血管生成相关的基因表达特征在舒尼替尼单一疗法下与更长的无进展生存期相关，但无法预测含ICI疗法的疗效。相反，与免疫相关的特征——包括阿维鲁单抗加阿昔替尼组中的JAVELIN Renal 101免疫特征以及纳武利尤单抗加伊匹单抗组中的HALLMARK炎症反应基因集——则与含ICI方案下的更长无进展生存期相关[9,10]。这表明，某一特征的预测价值取决于具体的治疗类型。考虑到这一点，联合疗法背景下单一生物标志物的可解释性变得更加复杂。

终点和试验设计问题
概念上的因素也为预测性生物标志物的发展带来了更多障碍。传统的随机对照试验通常旨在检测整个研究人群中针对单一总体主要终点（如总生存期）的平均治疗效果[21]。这对预测性生物标志物的评估有两方面的影响：首先，如果治疗效果仅限于由生物标志物定义的亚组，那么总体效应估计可能会被生物标志物阴性的患者稀释[22,23]；其次，由于样本量是根据整个人群计算的，预先规定的或事后的亚组分析通常力度不足[23,24]。然而，这并未解决预测性生物标志物的核心问题，即评估其在指导治疗决策方面的价值[21]。此外，不同研究之间主要终点的差异，以及使用替代终点而非具有临床意义的终点，也限制了研究结果的可比性。因此，专门的生物标志物试验可能更适合用于评估依赖于生物标志物的治疗效果。

经验教训：为何单一生物标志物失败
在肾细胞癌中，没有一种生物标志物被临床采用用于预测，这并非巧合。尽管人们在单一生物标志物的研究上付出了很多努力，但其临床应用受限的原因似乎是系统性的。这并不意味着单一生物标志物毫无价值；而是说，单一生物标志物方法可能不足以揭示癌症生物学的复杂性以及复合疗法的疗效。生物标志物仅是复杂生物系统的一个片段，该系统包含多种相互作用的途径、空间异质性（肿瘤微环境）、时间动态，以及不同治疗阶段之间的相互作用。因此，从实验室到临床的转化过程更加耗时且成本高昂，从而限制了其临床应用。这在目前大多数试验设计中也有所体现。尽管期望生物标志物能指导临床决策，但它们并未作为有效的预测工具充分融入试验的治疗流程中。由于单一生物标志物存在这些结构上的问题，因此需要多维度且综合性的模型。

未来方向
旨在提高肾细胞癌对ICI疗法反应预测能力的未来生物标志物策略将依赖于多组学方法，这类方法整合基因组、表观基因组、转录组及蛋白质组数据，以揭示疾病生物学背后的相互作用分子网络[25]。在肾细胞癌研究中，越来越多的努力集中在利用综合性方法来更好地描述空间异质性[26??]。多组学层面的整合加深了对肾细胞癌肿瘤生物学的理解，进而了解了治疗反应，包括VHL基因失活在血管生成和增殖途径中的关键作用[26??]。例如，单细胞转录组的空间定位显示，与体细胞突变相比，CD8阳性T细胞克隆型在肿瘤内的异质性更高，肿瘤边缘区域的上皮-间质转化也更为明显[27]。此外，还发现了一种具有免疫抑制信号特征并在肿瘤微环境中具有特定相互作用的新型促癌调节性T细胞亚群[28]。另外，空间转录组学有助于揭示细胞间的相互作用，加深我们对肿瘤微环境的理解，从而有可能帮助找到新的治疗靶点[26??]。由于肾细胞癌的对疗反应是由多种因素而非单一因素驱动的，多组学方法有望为临床决策提供更有价值的依据[26??]。肿瘤微环境的时间动态，表现为不同疾病阶段生物标志物表达的差异，凸显出需要转向纵向生物标志物评估的必要性。通过系列评估，可以更深入地了解潜在的生物学机制，或许还能揭示有助于提升生物标志物预测价值的时间性肿瘤动态。这对于液体活检技术而言尤其具有前景。例如，对比基线样本和治疗期间的ctDNA水平，或检测新出现的突变，可能反映出个体肿瘤生物学特征随治疗发生的变化[12]。这有助于更及时地调整治疗策略。

人工智能驱动的复合型和数字型生物标志物模型正成为生物标志物开发的一种有前景的方法。在透明细胞肾细胞癌中，利用机器学习从RNA测序数据中得出的氨代谢风险评分已被证明能够根据免疫疗法的反应对患者进行分类[29??]。此外，这类模型通过实现对多模态特征的灵活、数据驱动的权重分配，可能比简单的评分平均法更具优势。在复杂的生物系统中，用复合评分替代单一阈值方法可能更为合适。在未来研究中应用人工智能驱动的模型，有望帮助开发出更具综合性和临床意义的肾细胞癌预测性生物标志物[30?]。

为了克服转化肿瘤学领域当前的方法学局限，有必要创新试验设计和生物标志物验证方法。许多预测性生物标志物的提议依赖于回顾性试验和事后的亚组分析[4]。为了推动其临床应用，有必要开展前瞻性、按生物标志物分层的治疗试验，并在后续的前瞻性队列中进行外部验证。此外，研究可以在开始之前就将某些生物标志物的存在设定为入组标准，或者根据中期分析结果实施预先计划好的适应性调整。生物标志物应在试验开始时就明确界定，而非通过探索性发现来确定。要进一步发展肾细胞癌的预测性生物标志物，就需要设计更为严谨的试验。

在我们看来，将多组学方法、人工智能驱动的生物标志物模型以及以生物标志物为中心的试验设计纳入现有的基础设施规划——如数据共享联盟、平台试验计划以及检测方法标准化工作——是实现具有临床应用价值的生物标志物的最可行途径。

结论
目前，在临床实践中尚未成功建立任何可靠的预测性生物标志物来指导肾细胞癌的治疗决策。这部分是由于肿瘤内部和肿瘤之间的异质性，以及动态变化的肿瘤微环境所致。此外，不一致的评估方法、试验设计和终点指标也限制了试验的可靠性和可比性，而联合疗法的日益广泛应用更是让这一领域的研究变得更加复杂。综合性方法、纵向评估以及人工智能驱动的生物标志物模型似乎有望解决这些挑战。为了克服当前的局限性并开发出具有临床应用价值的生物标志物，有必要开展前瞻性、按生物标志物分层的治疗试验以及前瞻性验证研究。

致谢
无。

资金支持与赞助
无。

利益冲突
Shahrokh F. Shariat获得了以下报酬：薪酬：安斯泰来、阿斯利康、BMS、费林格、伊普森、强生、默克、奥林巴斯、辉瑞、罗氏、武田；咨询或顾问职务：安斯泰来、阿斯利康、BMS、费林格、伊普森、强生、默克、奥林巴斯、辉瑞、皮埃尔法伯、罗氏、武田；演讲事务：安斯泰来、阿斯利康、拜耳、BMS、费林格、伊普森、强生、默克、奥林巴斯、辉瑞、理查德·沃尔夫、罗氏、武田。其他作者声明与本稿无利益冲突。

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