《Cell》：Distinct cellular phenotypes of language and executive decline in amyotrophic lateral sclerosis
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肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）患者可见包括语言和执行功能损害在内的认知表现，但其潜在机制仍不清楚。研究人员通过整合空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）和单核RNA测序（
肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）患者可见包括语言和执行功能损害在内的认知表现，但其潜在机制仍不清楚。研究人员通过整合空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）和单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq），在一个经认知分层的患者队列中绘制了ALS患者前额叶皮层区域图谱。研究人员发现，ALS中的认知障碍与神经元功能障碍和胶质-血管失调的不同模式相关，这些模式因脑区和认知亚型而异。执行功能障碍与背外侧前额叶皮层（dorsolateral prefrontal cortex, DLPFC）深层神经元线粒体和突触活性降低有关，而语言相关缺陷则与涉及胶质和血管异常的弥散性全区域反应相关联。经多重成像验证的分析进一步识别出跨越运动和认知表型的前额叶皮层特征，包括多细胞胶质增生反应。研究结果表明，ALS的临床异质性由运动和大脑非运动区域中表型特异的细胞相互作用驱动。
### 研究背景
肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种致命的神经退行性疾病，以运动神经元丢失导致进行性瘫痪为特征。约半数患者表现出不同程度的运动外系统受累，临床表现从认知和行为正常的ALS到ALS伴额颞叶痴呆（frontotemporal dementia, ALS-FTD）呈现谱系分布。处于谱系中间范围的患者约占ALS患者的35%，表现为轻度认知和行为异常，包括语言缺陷、执行功能下降和情感淡漠。脑成像和尸检分析表明，这些认知和行为特征可预测大脑特定区域的功能障碍，提示ALS病理生理学存在区域易感性。然而，ALS中观察到的临床表型究竟源于共同的根源机制，还是源于脑区特异的细胞、分子、神经病理和遗传因素的相互作用，仍不清楚。
回答这一问题需要跨越临床表型分析、神经病理学与细胞水平分析的跨学科方法。然而，由于常规ALS诊疗中缺乏详细的认知评估，研究ALS的临床异质性一直颇具挑战。此外，尽管技术进展已开始提供对ALS的多细胞理解，疾病相关的细胞间相互作用和依赖性仍未得到充分认识。本研究对认知表型明确的ALS患者队列应用整合性空间生物学分析方法，以探究与认知损害相关的细胞和分子变化。
### 研究方法
研究人员从爱丁堡脑库（Edinburgh Brain Bank）获取脑组织样本，纳入36例ALS患者（其中19例认知正常，17例符合认知损害标准，即ALSci）和17例年龄匹配的神经典型猝死对照。所有ALS患者均接受了爱丁堡认知和行为ALS筛查量表（Edinburgh Cognitive and Behavioral ALS Screen, ECAS）评估。研究采用10× Genomics Visium平台进行空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）分析，对来自45例个体的246个Visium阵列（BA44/45: n=137, BA46: n=109）进行测序，共获得953,073个通过质量控制的空间斑点。同时采用10× Genomics Multiome技术获得配对基因表达和染色质可及性谱（snRNA-seq和snATAC-seq），并利用公开可用的260万个前额叶皮层snRNA-seq图谱训练机器学习分类器进行细胞类型注释。此外，研究还使用Lunaphore COMET平台进行全组织多重免疫荧光成像，对17例供体的31个全组织切片进行细胞分割、表型鉴定和形态学定量分析。研究采用Splotch贝叶斯层次模型进行空间差异表达分析，并通过Leiden聚类识别空间共表达模块。
### 研究结果
**研究概述与队列人口统计学特征**
研究建立了一个独特的ALS患者队列，所有患者均接受ECAS神经心理测试。基于ECAS评分，供体被分为三组：认知正常的ALS患者（n=19）、一个或多个认知域受损的ALS患者（ALSci；n=17）和年龄匹配的猝死神经典型对照（n=17）。语言损害是ALSci供体中最常受累的认知域。C9ORF72重复扩增和TDP-43病理均不能预测队列中的认知状态。
**ALS前额叶皮层多模式细胞图谱**
ST和snRNA-seq分析共鉴定出144,260个高质量细胞核，归属于七种主要细胞类型：兴奋性神经元（excitatory neurons, ENs）、抑制性神经元（inhibitory neurons, INs）、少突胶质细胞（oligodendrocytes, ODs）、OD祖细胞（OPCs）、星形胶质细胞（astrocytes, ASTs）、小胶质细胞（microglia, MIGs）和内皮细胞（endothelial cells, ENDOs）。各细胞类型在个体和条件间均被一致检测到，ALS与对照供体间无显著差异。
**胶质反应性是ALS前额叶皮层的常见特征**
在所有细胞类型中，ENDOs表现出最显著的转录变化，富集于免疫应答、凋亡和血管生成相关基因本体论（Gene Ontology, GO）条目。研究人员将胶质细胞分为不同功能状态：ASTs分为稳态和反应态，ODs分为低髓鞘化（PLP1
Low）和高髓鞘化（PLP1
High），MIGs分为稳态和反应性/炎症态，OPCs分为稳态、成熟中（OLIG1+）和应激态（NCOA1+）。与对照相比，ALS和ALSci供体中反应性MIGs和应激OPCs的比例显著增加，而反应性ASTs仅在ALSci供体中显著增加。反应性胶质细胞比例在个体样本内高度相关，提示存在协调反应。空间分析显示，反应性ASTs和MIGs在L1-L6层和白质（white matter, WM）中均显著增加，表明存在全层胶质增生反应。snATAC-seq分析显示，ALS供体的反应性ASTs和应激OPCs在染色质可及性增加的区域富集AP-1结合基序。在认知域层面，语言功能在胶质增生阳性组中显著较低，且该关联特异于BA44/45区域。
**反应性胶质增生的趋同转录和形态学特征**
多重免疫荧光成像分析显示，与对照相比，疾病供体中的ASTs显著更不呈球形（即更多分支），这种变化跨越皮层各层和WM，且与ST来源的星形胶质细胞反应性特征强相关。IBA1阳性细胞数量在疾病和对照之间无显著差异，但IBA1阳性面积在ALS和ALSci样本中显著减少，尤其在L1-L4层最为明显，提示小胶质细胞从分支状稳态形态向阿米巴样反应性形态的转变。
**空间表达特征区分ALS认知亚型**
通过Splotch模型和Leiden聚类，研究鉴定出23个空间共表达模块。执行功能损害与BA46中M8和M9模块的下调相关，这两个模块与线粒体功能（尤其氧化代谢）相关。言语流畅性损害与BA44/45中多个模块的上调相关。语言功能缺陷与胶质增生相关模块M2和M20在双侧区域的上调相关。对M2模块的亚模块分析揭示了内皮细胞、小胶质细胞和神经元核的转录特征，且从对照到ALS再到ALSci供体，M2亚模块间的空间交叉相关性逐渐增加，提示认知损害与通常空间分离的细胞过程的破坏和混合相关。
**血管周围微环境中的疾病相关变化**
血管周围分析显示，对照供体中IBA1阳性面积呈现明显的血管近端富集，而ALS和ALSci中血管附近的IBA1分布相对于对照减少，尤其在皮层浅层（L1-L4）和WM中。CD68（一种溶酶体糖蛋白和小胶质细胞吞噬活性标志物）的血管周围信号升高仅在ALSci供体中观察到，而对照和ALS个体血管附近CD68水平相对较低，提示ALSci中血管相关髓系细胞存在差异性激活。
**执行功能损害与BA46深层神经元相关**
M8和M9是与ECAS执行功能评分显著相关的唯一空间模块，且在BA46深层（L5和L6）特异下调。年龄相关的变化涉及BA44/45和BA46双侧L1-L5的神经元，而ALSci相关的变化仅涉及BA46深层（L5-L6）的神经元。在神经元亚型水平，L5 IT、L6 IT和L6 IT Car3兴奋性神经元以及L5-L6 LAMP5+/LHX6+和L5 PVALB+篮状抑制性神经元在ALSci供体中表现出M8和M9基因的显著下调。CALM2和GAPDH（M8和M9中表达最高的基因）在ALSci供体的BA46 L6 IT Car3 ENs和LAMP5+/LHX6+ INs中表达下调。
**执行功能障碍与线粒体和突触改变相关**
在执行功能损害相关的五种神经元亚型中，ALSci BA46差异表达转录本富集于三个主要GO条目：突触前（presynapse）、突触后（postsynapse）和线粒体膜（mitochondrial membrane）。ALSci供体表现出突触前基因表达降低（尤其涉及内溶酶体和突触囊泡酸化的V-ATPase基因），突触后谷氨酸受体亚基（如GRIK1、GRIA1和GRM1）表达增加，以及氧化磷酸化通路的强下调。氧化磷酸化和突触相关转录本在个体神经元亚型内跨供体相关，表明这些变化在同一组织中同时发生。TDP-43 eCLIP定义的直接mRNA靶标在差异表达基因中显著过表达，且主要上调，突触后是最显著受影响的细胞组分。
**TDP-43病理和认知损害具有部分不同的分子特征**
按TDP-43状态重新分组ALS供体后发现，许多与突触功能相关的神经元基因模块（如M6）在TDP-43
NEG供体中相对于对照变化极小，但在TDP-43
POS个体中显著上调。胶质增生相关模块（如M2）在TDP-43
NEG和TDP-43
POS供体中均显著上调，反应性胶质细胞比例在两组间相似。STMN2隐性剪接形式（TDP-43功能障碍的经典分子标志物）仅在TDP-43
POS供体中升高。这些数据表明TDP-43病理和认知缺陷在分子水平不完全重叠，胶质增生反应可能由替代机制驱动。
**认知损害的神经元-胶质细胞相关性**
跨区域供体水平分析显示，BA44/45和BA46之间存在共享的胶质增生模式，主要由ASTs和MIGs驱动。髓鞘化ODs（PLP1
High）和成熟中OPCs显示出区域特异性模式，在BA44/45和BA46之间的比例相关性较弱。两种OD亚型的丰度与神经元转录失调（尤其突触和线粒体相关基因）密切相关，神经元-OD-成熟OPC偶联成为样本内最强的关联之一。
### 总结与讨论
本研究将患者分层与两个前额叶皮层区域的无偏分析相结合，识别出与认知变化相关的空间定义特征，并追踪了与语言、言语流畅性和执行功能损害相关的分子模式。研究发现支持这样一种疾病模型：神经元、胶质细胞和血管之间的异常相互作用，而非脆弱神经元的单纯变性，在认知功能衰退中发挥机制性作用。这些相互作用在认知亚型间存在差异，表明疾病病因具有由不同机制驱动的异质性。
研究鉴定出ALS前额叶皮层中的两种不同胶质特征：一种是BA44/45和BA46共享的经典胶质增生反应，涉及反应性MIGs、反应性ASTs和应激OPCs在所有皮层各层和WM中的协调增加；另一种更具区域限制性，以OD谱系组成转变为特征。反应性胶质状态在ALS和ALSci之间大体共享，差异在于采用这些状态的细胞比例，提示认知损害与更广泛或更持续的共享胶质反应相关。这些胶质反应独立于TDP-43神经病理。
执行功能缺陷与BA46深层特定神经元亚型相关，这些神经元在突触过程和线粒体功能方面表现出显著的分子改变，其转录变化与OD和OPC丰度变化相关，提示执行缺陷源于协调的神经元-OD-OPC功能障碍。相比之下，语言和言语流畅性损害与更弥散的转录模式相关，主要涉及胶质和血管过程。TDP-43聚集本身不足以驱动ALS中的认知损害，可能依赖于其他疾病机制，包括观察到的神经元、胶质细胞和血管的协调反应。总之，ALS中的认知表型具有多细胞病因和区域特异性，TDP-43功能障碍是其中一个调节因素。
### 研究结论
认知表型在ALS中具有多细胞病因和区域特异性。执行功能障碍与BA46深层神经元亚型的线粒体和突触活性降低相关，而语言相关缺陷与涉及胶质和血管异常的弥散性全区域反应相关联。TDP-43功能障碍是调节因素之一，但单独的TDP-43聚集不足以驱动认知损害。临床异质性由运动和大脑非运动区域中表型特异的细胞相互作用驱动。
