急性心肌梗死后心源性休克患者接受体外膜氧合治疗的预后：一项回顾性生物信息学分析

《Emergency and Critical Care Medicine》：Prognosis of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) treatment on cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a retrospective bioinformatics analysis

　　背景：随着年龄增长和生活水平提高，急性心肌梗死后的心源性休克愈发常见。体外膜氧合技术是治疗此类患者的有效方法，但目前尚不清楚哪些基因和分子机制能够预测接受体外膜氧合治疗的心源性休克患者的预后。方法：从基因表达组在线数据库中获取了微阵列数据集（GSE93101，n=14），并进行了差异表达分析、加权基因共表达网络分析、基因本体论分析以及京都基因与基因组百科全书富集分析。为确定最重要的五个核心基因，我们利用蛋白质-蛋白质相互作用网络构建工具及Cytoscape软件进行分析。随后建立了基因-微小RNA网络，以识别可能调控这些核心基因的微小RNA。结果：将加权基因共表达网络分析中相关性最高的两个模块中的基因与差异表达基因进行交叉分析后，共得到10个基因。共有104个差异表达基因与氧化还原酶活性及代谢途径相关。通过Cytoscape软件确定了五个核心基因：CD68、C8A、NR1H4和ADGRE1基因表达水平下降，而TMPRSS6基因表达水平上升。TMPRSS6的亲和力最强，受29种微小RNA调控，而CD68、NR1H4、CD163和C8A分别受18、14、14和2种微小RNA调控。尽管CD163并非五大核心基因之一，但它受到的微小RNA调控数量更多。结论：通过综合分析，受18种微小RNA调控的CD68有望成为预测接受体外膜氧合治疗的心源性休克患者预后的生物标志物，其作用机制可能与巨噬细胞的激活和分化有关，进而影响梗死后炎症反应和组织修复。引言：急性心肌梗死是由于冠状动脉阻塞导致心肌缺血缺氧而引发的局部坏死，进而使血液供应急剧减少甚至中断[1]。伴有心源性休克的心肌梗死表现为外周器官和组织灌注不足，以及因缺血缺氧导致的脏器损伤，其主要原因是心脏功能异常，全球发病率约为3%–13%[2]。有效改善患者的血流动力学状态是成功实施紧急经皮冠状动脉介入治疗的前提和关键，该治疗可显著改善患者预后[3]。体外膜氧合技术是一种新兴技术，能够替代心脏的泵血功能，维持血液循环，并提供有效的呼吸和循环支持[4]。尽管体外膜氧合技术在救治心源性休克患者方面发挥着重要作用，但其死亡率依然较高。因此，探索能够影响这类患者体外膜氧合治疗预后的分子标志物和靶点具有重要意义。目前，微阵列分析等高通量实验方法已被广泛用于差异表达基因分析[5, 6]。大量微阵列数据存储在公共数据库中，GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是由研究人员提交的高通量微阵列数据的国际公共存储库，此外还有美国国家医学图书馆国家生物技术信息中心于2000年建立的下一代序列-功能基因组数据集。该数据库可存储原始数据、处理后的数据或元数据，这些数据可被索引、关联搜索。GEO数据库存储并免费分发微阵列数据、下一代测序数据以及其他形式的高通量功能基因组数据，目前已有超过100万个样本的数据可供公开查询。鉴于心源性休克患者的高死亡率以及对更个性化治疗靶点的需求，有必要探究与该特定患者群体体外膜氧合治疗结果相关的潜在分子机制和预后生物标志物。因此，本研究是对公开可用的基因表达数据集GSE93101进行的回顾性二次生物信息学分析。我们的假设是，特定的基因表达谱及其相关的分子机制与接受体外膜氧合治疗的心源性休克患者的临床预后（成功 vs 失败）存在显著关联。材料与方法：微阵列数据来源与处理：本研究为基于公开基因表达数据的回顾性二次生物信息学分析。微阵列数据集GSE93101来自基因表达组在线数据库（GEO），该数据库由美国国家生物技术信息中心管理。在开始体外膜氧合治疗时，从那些治疗成功的患者和治疗失败的患者中收集了33份外周血单核细胞样本，其中包括14例心肌梗死患者、6例急性心肌炎患者、6例扩张型心肌病患者、3例充血性心力衰竭患者、2例心律失常患者以及2例主动脉夹层患者。从该数据集中筛选出14例心肌梗死后出现心源性休克的患者，其中7例治疗成功（体外膜氧合治疗后存活超过7天），7例治疗失败（体外膜氧合治疗后7天内死亡或出现多器官功能衰竭）。该数据集是使用GPL570平台（[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）生成的。使用Sangerbox工具[7]（http://www.sangerbox.com/tool）来筛选治疗成功和失败的患者样本之间的差异表达基因。在本研究中，FDR校正后的P值小于0.05且|log2（倍数变化）|大于0.6的基因被视为差异表达基因。为降低这些阈值带来的假阳性风险，进一步采用了两步过滤策略，先将初步筛选出的差异表达基因列表与系统级共表达网络分析结果相结合，从而构建网络、识别基因模块并进行聚类分析。这些共表达模块会与临床特征相对应，同时还会计算基因显著性、模块显著性以及模块成员度。通过分析共表达模块与治疗结果之间的关联，确定出高度相关的模块以便后续分析（使用Sangerbox工具，软阈值设为6；网络类型为无符号加权网络；最小模块大小为30；模块合并阈值为0.35；核心基因筛选标准：模块成员度阈值设为0.8，基因显著性阈值设为0.1，权重阈值设为0.1）。差异表达基因的功能富集分析：使用名为DAVID的在线工具，即数据库注释、可视化与整合发现工具6.8版本（http://davidbioinformatics.nih.gov/），来评估这些差异表达基因的生物学意义。该工具进行了基因本体论术语富集分析和京都基因与基因组百科全书通路分析。基因功能被分为生物过程、分子功能以及细胞组分三大类。根据超几何分布检验标准，当FDR值小于0.05时，基因本体论术语富集结果具有统计学显著性；而当P值小于0.05时，京都基因与基因组百科全书通路分析结果则具有显著性。蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建与核心基因的识别：利用名为STRING的基因相互作用检索工具数据库（http://string-db.org/，置信度阈值设为0.7）来构建差异表达基因的潜在蛋白质-蛋白质相互作用网络，该数据库可提供蛋白质相互作用的整合信息。提取出的蛋白质-蛋白质相互作用网络随后使用Cytoscape 3.7.1版本（http://www.cytoscape.org）进行可视化展示。Cytoscape的CytoHubba插件被用来计算蛋白质节点的连接度，连接度最高的五个基因被视为核心基因。目标基因-微小RNA网络的构建：使用NetworkAnalyst工具（http://www.networkanalyst.ca/）来预测差异表达基因与微小RNA之间的相互作用，该工具是一个集成有各类微小RNA数据库的网页工具，这些数据库包括miRTarBase（https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/167）和TarBase（http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=tarbase/index）。根据表达数据的元分析结果构建了目标基因-微小RNA网络，在网络构建过程中选择了miRTarBase数据库，其他参数则采用该数据库的默认设置。结果：本研究使用了包含心肌梗死后心源性休克病例的GSE93101数据集，将这些病例分为治疗成功组和治疗失败组，进而进行差异基因表达分析。分析结果显示共有104个差异表达基因，其中37个基因表达水平上升，67个基因表达水平下降（见图1）。通过构建加权基因共表达网络，共识别出23个基因模块（见图2A）。对这些基因模块进行了聚类分析，brown4模块和darkolivegreen模块与治疗结果的绝对相关性最高，不过这种关联并未达到统计学显著性水平（P值大于0.05）。由于这两个模块的关联强度相对高于其他模块，因此被选为后续的探索性分析对象（见图2B、C）。将这两个模块中的基因与差异表达基因进行交叉对比，最终确定了10个与预后高度相关的基因（见图2D、表1）。为进一步提高统计可靠性，进而找出与预后表型最为相关的基因，我们采用了前述的两步过滤方法，即结合最初筛选出的104个差异表达基因，以及与临床预后相关性最高的两个加权基因共表达网络模块中的基因。表1：通过维恩图显示的与预后高度相关的10个基因。基因 logFC值 相关性程度
RAB3 -0.96 10.003
GPX3 -1.039 10.012
CST3 -0.625 0.013
ALDH2 -0.653 0.020
SMCO4 -0.779 0.026
RGL1 -0.930 0.038
CD68 -0.650 0.038
ADGRE1 -1.030 0.039
BATF3 -0.857 0.042
RRAS -0.647 0.043正logFC值表示在治疗成功的体外膜氧合治疗组中基因表达水平更高，负logFC值则表示在该组中基因表达水平更低（具体含义取决于差异表达分析中所采用的组别定义）。P值来自差异表达分析结果。ECMO即体外膜氧合技术。图1：GSE93101数据集中心肌梗死后心源性休克治疗成功组与失败组的差异基因表达分析结果。A图为火山图；B图为差异表达基因的聚类分析结果。DEG即差异表达基因。图2：通过加权基因共表达网络分析构建的共表达网络。A图为预后与模块特征之间的相关性热图；B图为brown4模块与治疗结果之间的散点图；C图为darkolivegreen模块与治疗结果之间的散点图；D图为这两个模块与差异表达基因交叉后的维恩图。WGCNA即加权基因共表达网络分析。对治疗成功组和治疗失败组中的差异表达基因进行了基因富集分析。基因本体论分析结果表明，这些差异表达基因大多与分子功能相关的术语有关，主要包括氧化还原酶活性、醛脱氢酶[NAD(P)+]活性、醛脱氢酶（NAD）活性、IgG结合功能、Ral GTP酶结合功能、免疫球蛋白结合功能、作用于供体的醛基或氧基功能、以NAD或NADP作为受体功能、UDP-N-乙酰葡萄糖胺-溶酶体酶N-乙酰葡萄糖胺磷酸转移酶活性、精氨酸-tRNA连接酶活性以及黑素细胞刺激激素受体活性（见图3A）。京都基因与基因组百科全书通路分析则显示，这些差异表达基因主要与多种代谢途径相关，包括糖酵解/糖异生途径、组氨酸代谢途径、β-丙氨酸代谢途径、花生四烯酸代谢途径、胰岛素信号传导途径、细胞衰老途径、青少年早发糖尿病途径、丙酮酸代谢途径以及精氨酸和脯氨酸代谢途径（见图3B）。这些富集的代谢途径主要参与代谢调节、炎症信号传导以及细胞应激反应，由此表明代谢重塑和炎症反应可能会影响接受体外膜氧合治疗的心源性休克患者的预后。图3：对治疗成功组和治疗失败组中所有差异表达基因进行的基因富集分析结果。A图为对这两组所有差异表达基因的基因本体论分析结果；B图为对这两组所有差异表达基因的京都基因与基因组百科全书通路分析结果。GO即基因本体论；KEGG即京都基因与基因组百科全书。利用STRING数据库构建了差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络。根据这些基因在网络中的连接度对其进行了评估（见图4A）。连接度最高的五个基因被确定为核心基因（见图4B）。分析结果显示，TMPRSS6的连接度最高，其次是CD68、C8A、NR1H4和ADGRE1。其中CD68、C8A、NR1H4和ADGRE1基因表达水平下降，而TMPRSS6基因表达水平上升。CD68和ADGRE1属于表1中列出的10个基因。图4：差异表达基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络。A图为通过STRING数据库分析得到的蛋白质-蛋白质相互作用网络；B图为通过Cytoscape 3.7.1版本确定的五个核心基因。根据表达数据，识别出了与差异表达基因有密切相互作用的微小RNA。分析结果还显示，TMPRSS6的亲和力最强，受29种微小RNA调控，而CD68、NR1H4、CD163和C8A分别受18、14、14和2种微小RNA调控（见图5）。尽管CD163并非五大核心基因之一，但它受到的微小RNA调控数量更多。图5：目标基因-微小RNA网络。A图为差异表达基因与其相关微小RNA构成的网络；B图显示CD68受18种微小RNA调控；C图显示TMPRSS6受29种微小RNA调控。miRNA即微小RNA。讨论：在本研究中，我们对接受体外膜氧合治疗的心源性休克患者的外周血单核细胞的基因表达微阵列数据进行了差异表达分析和加权基因共表达网络分析，最终共识别出104个差异表达基因，其中包括37个表达水平上升的基因和67个表达水平下降的基因。基因本体论富集分析显示，这些基因主要与氧化还原酶活性相关，这一功能类别的富集程度最为显著；而京都基因与基因组百科全书通路分析则表明，这些基因与多种代谢途径相关。通过PPI网络，我们利用Cytoscape软件筛选出排名前五的枢纽基因，进而构建了基因-微RNA网络，为后续研究提供了理论依据。在伴有心源性休克的急性心肌梗死患者中，即便使用大剂量血管活性药物或主动脉内球囊反搏装置，死亡率仍高达60%–80%[8]。心脏辅助装置能够稳定这类患者的血流动力学状况，为手术争取时间，从而提高生存率。近年来，心室辅助技术发展迅速[9]。经过40年的发展，该技术积累了更多临床经验，治疗效果显著提升，应用范围也大幅扩大，已有不少患者因此获救。不过，其复杂性、高昂成本等因素限制了其进一步的发展和应用。ECMO是一种改进型的人工心肺机，可在床边通过经皮血管穿刺快速安装，提供接近正常心输出量的循环支持与气体交换，能提高电除颤的成功率，还能避免患者复苏后再次出现心脏骤停[10]。它还能为经皮冠状动脉介入治疗创造有利条件[11]，并可作为对心脏骤停无效患者的替代方案，即体外心肺复苏[12]。因此，本研究旨在为将ECMO应用于更多急性心肌梗死后心源性休克患者提供理论依据。据我们所知，目前仅有少数研究探讨过接受ECMO治疗的急性心肌梗死后心源性休克患者的预后相关基因及分子机制。在本研究中，我们筛选出了若干可能有助于预测该类患者预后的候选枢纽基因及信号通路。为更精准地筛选与预后相关的基因，我们将差异表达基因与WGCNA相关模块中的基因进行交叉分析，再通过PPI网络构建和Cytoscape软件确定与预后相关的排名前五的基因，其中CD68与预后的相关性较高。本研究中识别出的连通性最高的枢纽基因是跨膜丝氨酸蛋白酶6（TMPRSS6），它是一种肝脏抗菌多肽——铁调素的负调控因子，这一功能最早由Du等人报道[13]。铁调素可通过诱导铁转运蛋白降解来抑制肠道对铁的吸收，进而降低全身铁含量，阻碍红细胞生成[14]。因此，TMPRSS6的正常表达对于维持机体铁平衡和红细胞生成至关重要。铁参与多种生理过程，如氧气的运输、储存与利用以及ATP的合成，对呼吸和能量代谢也有重要影响[15]。TMPRSS6主要通过负调控肝脏抗菌多肽铁调素来维持机体的铁平衡[16]。有研究[17]表明，缺氧诱导因子可能是TMPRSS6的上游调控因子。作为机体应对缺氧的关键因子，HIF-1α可诱导多种与铁代谢相关的蛋白质表达，进而影响造血和铁代谢。这条依赖HIF的调控通路会升高TMPRSS6的表达，促进细胞膜上血红素结合蛋白的脱落，同时降低肝细胞中铁调素的表达[18]。在缺氧环境下，可通过降低肝细胞中的SMAD信号通路来抑制铁调素的表达[19]。基于我们的研究结果，我们推测心肌梗死后，HIF-1α会作为TMPRSS6表达的上游调控因子，这种调控会影响机体的铁代谢平衡，进而影响呼吸和能量状态，而这些变化又可能影响患者的预后。我们的研究还发现有29种微RNA可调控TMPRSS6的表达，未来有必要进一步研究其作用机制。CD68属于溶酶体相关膜蛋白家族中的一类I型高糖基化跨膜蛋白[20]，在诊断和研究领域被广泛用作单核巨噬细胞的特异性标志物。巨噬细胞是由单核细胞分化而来的一类异质性细胞，是先天免疫系统的重要组成部分，具有吞噬、抗原呈递以及分泌生长因子、细胞因子等多种功能[21]。心肌梗死后的心脏重构可能导致心力衰竭、心脏破裂等严重后果。炎症和免疫反应是心肌损伤后的主要反应，对心脏重构起着重要作用[22]。作为重要的先天免疫细胞，巨噬细胞通过吞噬坏死细胞和碎片，在心肌梗死后的炎症反应和心脏重构过程中发挥关键作用[23]。巨噬细胞还能直接分泌细胞因子和生长因子来调控成纤维细胞等其他细胞的功能。另有研究[23]指出，外周血中的单核细胞会迁移到心肌梗死部位，并在不同微环境中分化为两种类型的巨噬细胞：经典活化型（M1型）巨噬细胞和交替活化型（M2型）巨噬细胞。M1型巨噬细胞可由脂多糖、Th1相关细胞因子及趋化因子诱导，能分泌白细胞介素、一氧化氮等物质，具有一定的促炎作用；而M2型巨噬细胞则具有抑制炎症、促进细胞增殖和血管生成的作用。在本研究中，我们发现CD68可能是反映急性心肌梗死后休克患者接受ECMO治疗预后情况的标志物之一，其作用机制可能与巨噬细胞分化有关。此外，作为巨噬细胞的标志物，CD68的表达水平可用于评估心肌梗死后的炎症程度和组织修复情况，进而影响患者的预后。综合来看，尽管TMPRSS6在网络中的连通性最高，但由于CD68得到了多种互补分析方法的一致支持，且在巨噬细胞活化、炎症反应和心肌修复方面具有明确的生物学功能，因此被优先考虑。所以，CD68或许是一种更为可靠、更具生物学合理性的生物标志物，适用于评估急性心肌梗死后心源性休克患者接受ECMO治疗后的预后。局限性本研究存在一些需要承认的局限性。首先，也是最突出的局限性在于样本量较小。我们的分析基于从公开数据集GSE93101中筛选出的14例接受ECMO治疗的急性心肌梗死后心源性休克患者，如此小的样本量可能会影响研究结果的统计效力和稳定性，因此此处呈现的结果应谨慎解读，仅可作为提出假设的依据，而非确证性或决定性的结论。其次，由于这是一项回顾性二次生物信息学分析，我们无法考虑潜在的临床混杂因素，比如合并症、休克严重程度或特定的ECMO参数等，因为这些因素的详细数据在公共数据库中并不总是完整，而这些因素都可能影响基因表达和预后。最后，我们从调控网络分析（微RNA-基因）中得到的结果仅为预测性结论，缺乏体外或体内的实验验证。此外，部分分析中采用了相对宽松的统计阈值，且未进行多重检验校正，这可能会增加出现假阳性结果的风险。未来有必要开展更大规模、多中心的前瞻性研究，以验证所筛选出的枢纽基因和分子通路。结论通过对GSE93101数据集的回顾性生物信息学分析，我们发现了急性心肌梗死后心源性休克患者接受ECMO治疗时的预后相关分子特征。差异表达基因主要与代谢途径和氧化还原酶活性相关。CD68和TMPRSS6被确定为最具前景的两种预后枢纽基因，其作用机制可能与巨噬细胞分化和铁代谢有关。根据维恩图（表1）和Cytoscape分析的结果，我们认为CD68有望成为急性心肌梗死后接受ECMO治疗患者的预后生物标志物。尽管样本量较小（n=14），难以得出确证性结论，但我们的研究结果为未来大规模临床研究将CD68作为新型生物标志物提供了假设基础。利益冲突声明作者声明不存在利益冲突。作者贡献刘C负责研究设计、数据分析和论文撰写；李W负责数据采集和数据分析；刘S负责研究设计并审阅了 manuscript。资金支持无。研究伦理审批及知情同意不适用。致谢无。