精氨酸通过RARS1介导的HES1精氨酸化作用，缓解支气管肺发育不良相关的肺动脉高压

《Emergency and Critical Care Medicine》：Arginine attenuates bronchopulmonary dysplasia-associated pulmonary hypertension via RARS1-mediated arginylation of HES1

　　背景：支气管肺发育不良是一种复杂的慢性肺部疾病，其形成是肺部发育与产前及产后损伤因素相互作用的结果。患有该病的婴儿中，有多达三分之一会进一步出现肺血管功能障碍，进而发展为慢性肺动脉高压。这类患儿死亡率更高，神经发育不良的风险也更大，且目前尚无有效的治疗方法。

方法：本研究从山东大学附属儿童医院招募了30名研究对象，数据收集时间为2023年1月至2025年5月。通过代谢物分析，我们发现精氨酸浓度存在显著差异。随后通过体外实验探讨精氨酸对血管内皮细胞增殖和迁移能力的影响，并阐明相关分子机制。最后通过体内实验验证精氨酸在缓解支气管肺发育不良相关肺动脉高压中的作用。

结果：体外实验表明，精氨酸能够抑制血管内皮细胞的增殖和迁移。分子机制研究显示，精氨酸可通过精氨酰-tRNA合成酶-1与HES1通路降低α-平滑肌肌动蛋白、缺氧诱导因子-1α及相关蛋白的表达，其中RARS1会直接与HES1结合，而精氨酸可增强这一过程，从而改善血管内皮细胞功能。进一步的体内实验表明，补充精氨酸可保护新生大鼠免受高氧引起的肺损伤和肺动脉高压。

结论：我们的研究结果表明，精氨酸可通过RARS1-HES1通路促进血管内皮细胞重塑，从而缓解支气管肺发育不良相关肺动脉高压。补充精氨酸或可为预防该病提供新的治疗手段。

引言：支气管肺发育不良是一种慢性肺部疾病，因早产儿肺部发育受限和受损所致，其特征为远端肺泡发育不全，通气及气体交换功能下降。肺泡及血管周围微环境的发育也会受到阻碍，最终导致支气管肺发育不良的形成。这一病理过程直接导致呼吸功能无法满足机体生长发育的需求，临床表现为需吸氧以及缺氧引发的多种系统并发症。肺部结构的重塑也是成年后慢性肺部疾病发展的重要结构基础。随着先进的新生儿护理技术和高效呼吸支持设备的应用，早产儿的存活率不断提高，支气管肺发育不良的发病率也随之上升[1–3]。值得注意的是，这类患者中有相当比例会同时出现肺动脉高压，而且胎龄与肺动脉高压的发病率之间存在显著负相关关系，这已成为新生儿重症监护领域的重要临床挑战[4]。在婴儿群体中，支气管肺发育不良合并肺动脉高压的患病率可达19.4%–40.0%，死亡率高达38%，是导致新生儿发病和死亡的主要原因之一[5]。该病的病因较为复杂，是肺部发育与产前及产后损伤因素相互作用的结果，进而导致气体交换障碍、肺血管收缩加剧、肺血管结构重塑，最终使肺动脉压力升高[6]。支气管肺发育不良会严重损害肺血管发育，引发持续的气道和肺血管疾病。在这一过程中，血管内皮细胞功能紊乱起着关键作用，而血管内皮细胞的增殖则是导致动脉结构重塑的重要因素。功能异常的血管内皮细胞会影响肺动脉高压的多个方面，包括肺血管张力、炎症反应、凝血功能、新陈代谢以及血管结构重塑等。鉴于越来越多的证据表明血管内皮细胞是肺动脉高压发生和发展过程中的重要介质，针对肺动脉高压的新疗法或许可以着眼于改善血管内皮细胞的机能紊乱及其信号传导功能[7]。

氨基酸是细胞内最重要的代谢物质之一。除了参与蛋白质合成外，许多氨基酸还参与调控多种重要的信号通路。L-精氨酸是一种半必需氨基酸，既可通过饮食获取，也可由L-瓜氨酸合成。目前的研究正在探索通过补充L-精氨酸或提高其生物利用度来作为治疗手段，其作用机制在于改变L-精氨酸与一氧化氮的平衡状态。一氧化氮作为一种重要的信号分子，具有舒张血管、抑制血小板聚集和炎症反应等多种功能，对维持机体血管健康至关重要[8]。在动脉粥样硬化模型研究中，补充L-精氨酸可显著提高血管中的一氧化氮水平，并减少动脉斑块面积[9]。研究表明，补充L-精氨酸能够降低血压并逆转血管结构重塑[10]。此外，在大鼠心肌缺血再灌注损伤后，补充L-精氨酸还可缩小梗死范围[11]。在老年动物模型中的研究显示，衰老会导致精氨酸酶活性上升，而外源性补充L-精氨酸可部分逆转血管老化现象[12]。然而，精氨酸在支气管肺发育不良相关肺动脉高压中的作用尚未被研究，其效果仍有待进一步探索。已有研究指出，精氨酸在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、肺动脉高压以及支气管肺发育不良等多种肺部相关疾病中都发挥着作用[13]。但最近的研究发现，氨基酰-tRNA合成酶是一类高度保守的酶家族，在生物体内约有30种亚型。氨基酸可促使氨基酰-tRNA合成酶与其底物结合，该酶的经典功能是催化生成用于蛋白质合成的氨基酰-tRNA底物[14]，除此之外它还具有转录调控、RNA剪接、免疫调节以及细胞应激反应等非经典功能[15]。

HES1属于碱性螺旋环螺旋结构家族的转录抑制因子[16]，它在平滑肌分化、血管生成、动静脉命运决定以及血管形态构建等过程中起着关键作用，是影响肺动脉高压状态下血管内皮细胞重塑的重要转录因子[17, 18]。研究表明，HES1可参与调控多种下游分子的转录表达：α-平滑肌肌动蛋白能够促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移[19]；血管内皮生长因子可通过增强血管通透性、促进内皮细胞迁移、增殖以及血管生成来推动血管生成[20]；瞬时受体电位通道1会影响顶端血管内皮细胞的迁移和增殖，进而导致血管生成缺陷[21, 22]；缺氧诱导因子-1α能够激活血管内皮生长因子，从而促进血管生成和血管舒张[23]；周期依赖性激酶调节因子P27Kip1则是一种能够诱导细胞周期停滞的生长抑制剂[24]。深入理解这些机制有助于更好地了解疾病的发生发展机制以及肺部的修复和再生过程，为寻找新的治疗靶点提供依据。目前，关于精氨酸与HES1之间调控网络的分子机制尚未见相关文献报道，精氨酸是否可通过氨基酰-tRNA合成酶的非经典功能缓解支气管肺发育不良相关肺动脉高压，目前仍不清楚。我们的研究显示，精氨酸可通过促进精氨酰-tRNA合成酶-1与HES1结合，并调控HES1的精氨酰化修饰，从而改善血管内皮细胞功能，有效缓解支气管肺发育不良相关肺动脉高压，这一发现为该病的防治提供了新的治疗策略。

材料与方法

人类血清样本：从两组新生儿中采集外周血样本，分别为正常新生儿（n = 10）和患有支气管肺发育不良相关肺动脉高压的新生儿（n = 20）。这些样本均来自山东大学附属儿童医院。本研究共招募了30名研究对象，数据收集时间为2023年1月至2025年5月。为保证研究对象的同质性，排除了患有先天畸形、遗传性代谢疾病、恶性肿瘤或严重原发性疾病的新生儿。所有被诊断为支气管肺发育不良相关肺动脉高压的新生儿均符合临床诊断标准。本研究已获得山东大学附属儿童医院伦理委员会的批准（SDFE-IRB/P-20250003），且所有实验均按照相关指南和规定进行。在研究对象入院时，已获得其本人或法定监护人的书面知情同意。由于本研究旨在探索相关机制，样本量是根据实际操作可行性及临床招募情况确定的。

动物实验：实验用动物及其母鼠在山东第一医科大学动物中心饲养，饲养环境为无特定病原体环境，光照周期为12小时亮光/12小时黑暗，环境温度为22±1℃，湿度为30%–50%，动物可随时获取食物和水。本研究的所有操作流程均获得了济南儿童医院、山东大学齐鲁儿童医院伦理委员会的批准，所有实验均遵循山东大学附属儿童医院SDFE-IRB/P-20250003《实验动物护理与使用指南》中的要求进行。

肺动脉高压模型建立与药物给药：本实验采用了高氧暴露诱导的新生大鼠支气管肺发育不良相关肺动脉高压模型。肺动脉高压组大鼠从出生后第1天到第5天持续处于70%的高氧环境中，从第6天到第14天转为21%的正常氧环境，而PH-Arg组则注射等量的磷酸盐缓冲液作为对照[25, 26]。PH-Arg组大鼠的模型建立方式与肺动脉高压组相同，也在出生后第6天、第8天和第9天分别腹腔注射3次浓度为50毫克/千克的精氨酸溶液。为减少实验偏差并保证公平性，动物的性别是随机分配的，所有动物均采用随机分组方法，每组4只大鼠用于后续指标检测。动物实验共分为三组：对照组、肺动脉高压组以及肺动脉高压加精氨酸组。参与实验检测和分子生物学实验的研究人员对分组情况不知情，每个干预组都设有相应的对照组。本研究符合《动物研究：体内实验报告指南》的要求。

细胞培养：hCMEC/D3细胞和293T细胞均购自中国武汉的Procell公司。hCMEC/D3是人类脑微血管内皮细胞系，该细胞系来源于癫痫手术中切除的富含脑内皮细胞的组织。这类细胞具有类似上皮细胞的形态，能够附着在表面生长，具备多种内皮细胞特征。hCMEC/D3的传代比例为1:2，传代周期为2–3天。293T细胞系则是常用的人类胚胎肾细胞系。这两种细胞均在添加了10%牛胎血清的Dulbecco改良伊格尔培养基中，在标准培养箱条件（5%二氧化碳、94%氧气、37摄氏度）下培养，同时保持环境湿度在90%以上，以防止培养基蒸发。

细胞增殖检测：在实验开始24小时前，将细胞以最佳密度接种到96孔板中。实验时将细胞浓度调整至70%融合度，以确保细胞处于活跃生长状态。随后用不同浓度梯度的含药培养基替换原有培养基（同时设置对照组）。向每个孔中加入10微升CCK-8试剂，培养2小时后，在450纳米波长处测量吸光度，每个浓度组设置三个重复孔以提高结果的可靠性。

划痕实验：将对数生长期的细胞接种到6孔板中，过夜培养至100%融合。使用无菌的200微升移液器吸头在培养板盖子上划出垂直的划痕。用PBS轻轻洗涤细胞3次，然后加入含有不同浓度梯度药物及对照组的无血清培养基。在多个时间点下，使用倒置显微镜（4倍物镜）观察划痕闭合情况，每个孔拍摄四个视野以确保数据的代表性。使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院官网：https://imagej.net/ij/）对划痕面积进行量化。数据统计计算公式为：(初始划痕面积 - 药物处理后的划痕面积)/初始划痕面积×100%。

西方印迹试验：将细胞在含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀试验缓冲液中裂解，离心（12,000转/分钟，20分钟，4摄氏度）后收集上清液。使用比色法试剂盒（北京百奥赛图公司）测定上清液中的蛋白质浓度。将20微克/孔的蛋白质在加载缓冲液中变性10分钟（100摄氏度），然后通过SDS-PAGE电泳分离（堆叠凝胶电压为80伏，分离凝胶电压为120伏），再将蛋白质转移到经甲醇活化的聚氯乙烯膜上。用5%脱脂牛奶封闭膜2小时，然后在4摄氏度下与一级抗体孵育过夜，之后用含0.2% Tween-20的TBST溶液洗涤，再在室温下与二级抗体孵育1小时。使用增强型化学发光法检测蛋白质条带，并通过ImageJ软件进行分析。数据统计分析使用GraphPad Prism软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥市的GraphPad Software公司）完成。

共免疫沉淀试验：转染后的细胞先用PBS洗涤3次，然后在含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的冰冷缓冲液中裂解。将裂解液离心（12,000转/分钟，20分钟，4摄氏度）后，取上清液与10微升蛋白A/G琼脂糖珠以及2微升抗体在4摄氏度下孵育过夜。IgG抗体作为阴性对照。将琼脂糖珠用缓冲液洗涤5次，然后用加载缓冲液洗脱结合的蛋白质，随后进行西方印迹试验分析。

实时聚合酶链反应：在大鼠颈椎脱位后收集其肺组织用于实验。总RNA的提取使用的是SPARKeasy试剂盒（AC0202-B，Spark，济南，中国），随后通过荧光法进行定量分析。cDNA的合成则采用Takara逆转录试剂盒。定量聚合酶链反应在CFX96系统中进行，反应条件为：95℃下加热5分钟；随后进行40轮循环，每轮包括95℃下15秒、58℃下30秒以及72℃下20秒。β-actin mRNA被用作内参。各组的ΔCt值经过分析后，不同组间的mRNA表达量以2?ΔCt值作为标准化值（见表1）。

表1 本研究中使用的引物
引物 正向序列（5’-3’） 反向序列（5’-3’）
p27kip1 TAATTGGGGCTCCGGCTAACTTGCAGGTCGCTTCCTTATTCCHI
F-1α CACCACAGGACAGTACAGGATCGTGCTGAATAATACCACTCACATR
PC1 AGGAACTAGCCCGGCAATGTAGCTCGTCACTAGACGTATGGTTT

F-1α为缺氧诱导因子-1α；TRPC1为瞬时受体电位通道1。

统计分析
所有数据均来自至少2次独立实验。所有获取的数据都被纳入统计分析，没有缺失或排除的数据。本研究中的统计分析使用GraphPad Prism 8软件（GraphPad Software）完成。连续数据以均值±标准差的形式呈现。当数据符合正态分布时，我们使用学生t检验来分析数据间的差异；而分类数据则以百分比形式呈现，并根据情况选择卡方检验或费舍尔精确检验。P值小于0.05被视为具有统计学显著性。

研究结果
支气管肺发育不良相关肺动脉高压患儿血清精氨酸水平较低
我们对患有BPD-PH的患儿以及非BPD-PH对照组的患儿进行了血清精氨酸水平检测。如图1A和B所示，BPD-PH患儿的胎龄更短，属于极早产儿范畴，且出生体重也低于非BPD-PH患儿。与非BPD-PH对照组相比，BPD-PH患儿的血清精氨酸浓度较低，但差异无统计学意义。

图1. 精氨酸可缓解体内肺动脉高压。(A)样本信息。表格显示的是均值±标准差。统计显著性是通过双尾非配对学生t检验确定的。(B)血清中的精氨酸含量是通过LC-MS/MS技术测定的。图表显示的是均值±标准差。体重和胎龄数据的P值是通过双尾非配对学生t检验得出的，其余数据的P值则是通过费舍尔精确检验得到的。LC-MS/MS即液相色谱-串联质谱分析；PH指肺动脉高压；SD为标准差。

精氨酸可促进内皮细胞的表型转化
在观察到精氨酸水平存在差异后，我们在细胞培养体系中添加精氨酸，以验证其对BPD-PH的影响，并观察细胞迁移和增殖能力的变化。如图2A和B所示，添加精氨酸显著降低了细胞的增殖能力和迁移能力。鉴于血管表型重塑也是BPD-PH的重要诱因，我们进一步检测了TRPC1、HIF-1α和P27Kip1的mRNA水平，以及α-SMA和VEGF的蛋白表达变化。如图2C和D所示，精氨酸增加了VEGF和P27Kip1的表达，同时降低了α-SMA、TRPC1和HIF-1α的水平。这些发现表明，补充精氨酸可以改善血管内皮细胞的功能障碍，表现为增强细胞收缩力，同时降低其增殖、迁移和分泌能力。这说明精氨酸在细胞层面能够缓解肺动脉高压的表型特征。

图2. 精氨酸可促进内皮细胞稳定。(A)hCMEC/D3细胞分别在不同浓度的精氨酸（0.01、0.1或1 mM）作用下培养15小时。在0小时时制造划痕伤口，并在10倍放大倍数下进行成像，15小时后再次对相同视野进行成像，每组样本数为4个。(B)如(A)组处理后的细胞与CCK-8溶液共同培养，然后在450纳米波长处测量吸光度，每组样本数为5个。(C)如(A)组处理后的细胞中α-SMA和VEGF的蛋白表达情况，每组样本数为3个。(D)如(A)组处理后的细胞中TRPC1、HIF-1α和P27Kip1的mRNA水平，每组样本数为3个。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，显著差异通过学生t检验确定。图表显示的是均值±标准差。HIF-1α为缺氧诱导因子-1α；α-SMA为α-平滑肌肌动蛋白；TRPC1为瞬时受体电位通道1；VEGF为血管内皮生长因子。

精氨酸类似物可拮抗精氨酸介导的内皮细胞转化
精氨酸的结构类似物——硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）能够拮抗精氨酸的作用[27]。由于精氨酸可促进内皮细胞的表型转化，我们加入了这种结构类似物以进一步验证精氨酸的作用。如图3A和B所示，添加L-NAME后，细胞的迁移能力得到提升，增殖能力也有所增强。如图3C和D所示，与接受精氨酸处理的对照组相比，添加L-NAME后VEGF和P27Kip1的水平下降，而α-SMA、TRPC1和HIF-1α的表达则上升。这些结果表明精氨酸的作用被抑制，进一步证明了内皮细胞表型转化的促进作用是由精氨酸特异性介导的。

图3. L-NAME可消除精氨酸的作用。(A)hCMEC/D3细胞分别在不同处理条件下培养15小时：单独用精氨酸处理、用L-NAME处理（一氧化氮合酶抑制剂），或同时用精氨酸和L-NAME处理。在0小时和15小时时进行伤口愈合检测，放大倍数为10倍，每组样本数为4个。(B)如(A)组处理后的细胞进行CCK-8检测，每组样本数为5个。(C)如(A)组处理后的细胞中α-SMA和VEGF的Western blot检测结果，每组样本数为3个。(D)如(A)组处理后的细胞中TRPC1、HIF-1α和P27Kip1的mRNA水平通过qPCR技术检测，每组样本数为3个。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，显著差异通过学生t检验确定。图表显示的是均值±标准差。Arg为精氨酸；HIF-1α为缺氧诱导因子-1α；L-NAME为硝基-L-精氨酸甲酯；qPCR为定量聚合酶链反应；α-SMA为α-平滑肌肌动蛋白；TRPC1为瞬时受体电位通道1；VEGF为血管内皮生长因子。

精氨酸可促进精氨酰-tRNA合成酶-1与HES1的结合
为探究精氨酸发挥作用的分子机制，我们研究了精氨酸是否通过RARS1介导HES1的精氨酰化作用来调控基因转录。我们对RARS1与HES1之间的相互作用进行了分子对接预测。如图4A所示，预测结果显示RARS1可能与HES1发生相互作用。我们在293T细胞中过表达了RARS1和HES1两种蛋白。如图4B和C所示，RARS1可直接与HES1结合，而添加精氨酸可显著增强这种结合作用。这些发现表明精氨酸可作为RARS1的底物，促使RARS1对HES1进行精氨酰化修饰，从而通过转录调控实现内皮细胞的表型转化。

图4. RARS1可与HES1结合。(A)HES1与RARS1相互作用的分子对接预测。该预测是通过HADDOCK网站（https://rascar.science.uu.nl/haddock2.4/）完成的。(B)共免疫沉淀实验：在过表达HES1和RARS1的293T细胞中，分别加入或不加入1 mM的精氨酸处理15小时，之后通过HES1的免疫沉淀来检测RARS1的存在。(C)反向共免疫沉淀实验：对如(B)组处理过的细胞进行RARS1的免疫沉淀，以此检测HES1的存在。HES1为hairy and enhancer of split homologue-1；RARS1为精氨酰-tRNA合成酶-1。

敲低精氨酰-tRNA合成酶-1和HES1的表达可逆转精氨酸的作用，促进二者结合
为进一步证实精氨酸是通过RARS1和HES1发挥生物学功能的，我们在给细胞添加精氨酸的同时，敲低了HES1和RARS1的表达。如图5A和B所示，与仅添加精氨酸的对照组相比，敲低这两种基因后，细胞的迁移和增殖能力均得到提升。如图5C和D所示，与仅添加精氨酸的对照组相比，VEGF和P27Kip1的水平下降，而α-SMA、TRPC1和HIF-1α的表达则上升。敲低RARS1和HES1后，精氨酸促进内皮细胞表型转化的作用被完全消除，这进一步证明了精氨酸是通过RARS1和HES1来介导这一过程的。

图5. siRNA可逆转精氨酸的作用。(A)hCMEC/D3细胞被siRNA处理48小时。在0小时和15小时时进行伤口愈合检测，放大倍数为10倍，每组样本数为4个。(B)hCMEC/D3细胞先如(A)组那样处理，之后加入CCK-8溶液并在450纳米波长处测量吸光度，每组样本数为5个。(C)如(A)组处理后的hCMEC/D3细胞中α-SMA和VEGF的蛋白含量，每组样本数为3个。(D)如(A)组处理后的hCMEC/D3细胞中TRPC1、HIF-1α和P27Kip1的mRNA水平分析结果，每组样本数为3个。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，显著差异通过学生t检验确定。图表显示的是均值±标准差。HES1为hairy and enhancer of split homologue-1；HIF-1α为缺氧诱导因子-1α；RARS1为精氨酰-tRNA合成酶-1；α-SMA为α-平滑肌肌动蛋白；TRPC1为瞬时受体电位通道1；VEGF为血管内皮生长因子。

精氨酸可缓解体内肺动脉高压的症状
鉴于精氨酸在体外可促进内皮细胞的表型转化，我们在新生大鼠中建立了肺动脉高压的体内模型，随后采集肺部组织进行检测。如图6A–C所示，与模型组相比，添加精氨酸的组中TRPC1和HIF-1α的mRNA水平下降，而P27Kip1的mRNA表达则上升。这些结果表明，在肺动脉高压模型中，外源性精氨酸的补充可促使内皮细胞向具有收缩功能的表型转变，这一结果与体外实验结论一致。

图6. 精氨酸可缓解体内肺动脉高压的症状。动物实验分为三组：对照组、肺动脉高压组以及肺动脉高压加精氨酸组。(A)显示的是肺部组织中P27Kip1的mRNA水平。(B)显示的是肺部组织中HIF-1α的mRNA水平。(C)显示的是肺部组织中TRPC1的mRNA水平，每组样本数为4个。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，显著差异通过学生t检验确定。图表显示的是均值±标准差。Arg为精氨酸；HIF-1α为缺氧诱导因子-1α；PH指肺动脉高压；TRPC1为瞬时受体电位通道1。

讨论
在本研究中，我们首先从患有BPD-PH的患儿以及非BPD-PH的患儿身上采集血清样本，以检测精氨酸代谢物的水平。检测结果显示，患病患儿的血清精氨酸水平低于正常患儿，这一现象表明补充外源性精氨酸可能成为治疗BPD-PH的一种新方法。因此，我们给患儿补充外源性精氨酸，结果发现它能够抑制细胞的增殖和迁移，同时改善血管内皮细胞的功能障碍，从而证明了精氨酸的生理功能。此外，添加精氨酸的结构类似物后，其作用也被抑制。在机制研究方面，我们发现精氨酸可通过RARS1调控HES1的表达，并促进二者之间的结合。进一步敲低HES1和RARS1的表达后，精氨酸的作用也被消除。最后，在大鼠的BPD-PH体内模型中，补充精氨酸可减轻该疾病对血管内皮细胞功能的损害。我们的研究结果有助于深入理解BPD-PH复杂的病理生理机制，为针对性治疗方案的开发提供依据。

先前的研究已表明，瓜氨酸能够减轻新生大鼠肺损伤引起的肺动脉高压，而精氨酸可通过一氧化氮合酶转化为瓜氨酸，同时释放出一氧化氮[28]。因此，我们认为精氨酸在BPD-PH的发生和发展过程中也起着关键作用[29]。临床研究人员发现，一氧化氮合酶家族的所有成员都以L-精氨酸为底物来产生一氧化氮。在胎儿肺发育过程中，肺和气道中的一氧化氮生成可调节气道和血管平滑肌的张力[30]。我们认为，精氨酸不仅是一氧化氮生成的底物，还可能通过精氨酰化修饰发挥作用，即通过RARS1调控HES1的表达，从而产生多种效应。另一方面，蛋白质的翻译后精氨酰化是细胞内众多生理途径的重要调控因素。N端精氨酰化在早期血管生成过程中起着关键作用，这一过程是由精氨酰-tRNA转移酶介导的[31, 32]。与此一致，我们发现了RARS1介导的精氨酰化修饰在肺血管调节中的保护作用。

局限性
本研究存在若干局限性。首先，本研究涉及的样本量较小，因此无法充分证明精氨酸作为治疗药物的安全性与有效性。其次，精氨酸的治疗效果仅在动物模型中得到验证，其对患者的实际治疗效果仍不确定。最后，我们的体外实验仅在一种细胞类型中进行。鉴于早产儿肺发育不良是由多种细胞状态异常引起的，我们无法排除精氨酸在其他细胞类型中也可能发挥类似作用的可能性。由于本研究旨在探索其潜在机制，样本量的确定是基于临床招募的实际可行性与具体情况。

结论：总体而言，我们发现，在早产儿肺发育不良中，补充精氨酸可通过RARS1介导的HES1精氨酰化修饰来调节血管内皮细胞功能。本研究阐明了HES1精氨酰化修饰调控血管内皮细胞功能的分子机制，同时为探索氨基酰化修饰在生理和病理过程中的作用奠定了基础。这些发现有助于提高极低出生体重和超低出生体重早产儿的生存率。此外，这项研究还为通过干预精氨酸代谢来调节早产儿肺发育不良中的HES1功能提供了可能性。目前尚无针对RARS1-HES1通路的治疗策略，未来我们将针对这一通路开发新的治疗方法，为早产儿肺发育不良的临床预防和治疗提供新的靶点与方向。

利益冲突声明：作者声明不存在利益冲突。

作者贡献：李Y和周D设计并完成了大部分实验，分析了数据，并撰写了论文。戴X参与了小鼠实验。李云霞和韩Y负责临床样本的收集与分析。康L和李X负责实验的概念设计、监督及结果解读。

资金支持：本研究得到了山东省医疗卫生科技发展计划（项目编号：202206030328）以及海佑健康高端人才项目的资助（项目编号：202412）。

研究伦理批准与知情同意：本研究遵循2013年修订的《赫尔辛基宣言》原则。该研究涉及人类与动物实验，已获得山东大学齐鲁儿童医院（批准编号：QLET-IRB/P-2021055；2021年10月10日）的批准。由于患者不具备自主同意能力，已从其监护人处获得书面知情同意。所有实验均按照山东大学附属儿童医院实验动物护理和使用指南（批准编号：SDFE-IRB/P-20250003）中的要求进行。

致谢：我们感谢患者及其家属允许我们开展此项研究。同时，我们也感谢上述两项基金提供的财政支持，以及山东大学附属儿童医院所提供的研究平台。