**论文解读：骨髓微环境中的潜伏效应T细胞介导免疫治疗应答**

**研究背景与目的**

多发性骨髓瘤（MM）和急性髓系白血病（AML）作为最常见的骨髓驻留恶性肿瘤，其治疗策略近年来取得了显著进展，尤其是免疫疗法的应用。然而，与实体瘤中T细胞介导的抗肿瘤免疫研究相比，研究人员对骨髓微环境中内源性T细胞如何发挥免疫监视作用、其抗原特异性、功能状态及临床相关性仍知之甚少。现有研究面临的主要挑战包括：骨髓微环境中的T细胞大多为“旁观者”细胞，真正的肿瘤反应性T细胞克隆型（clonotype）频率极低，难以识别和表征；此外，MM和AML的肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden, TMB）较低，经典突变衍生新抗原（neoantigen）稀缺，这使得寻找可被T细胞识别的免疫原性靶点变得困难。因此，迫切需要建立一个统一的框架，以系统性地定义骨髓恶性肿瘤中内源性抗肿瘤T细胞免疫的本质、特异性及其功能相关性，为优化免疫治疗策略提供理论基础。

**研究内容与结论**

为攻克上述难题，研究人员开展了一项综合性研究。他们整合了高灵敏度TCR分析、HLA免疫肽组学（HLA immunopeptidomics）和功能性单细胞筛选技术，对MM和AML患者骨髓中的肿瘤反应性T细胞（BMTs）进行了全面的表征。研究得出以下核心结论：首先，骨髓中的肿瘤反应性T细胞在转录组学上定义了一个保守的效应程序，这是一种与实体瘤中肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的耗竭表型截然不同的状态，研究人员将其称为“潜伏胜任”状态（latent competent state）。其次，通过HLA-I类免疫肽组学分析，研究人员发现MM和AML的肿瘤免疫肽组（immunopeptidome）主要由非经典肽段（noncanonical peptides）构成，而非经典突变衍生新抗原，并揭示了一个部分共享的抗原景观，这些抗原能够驱动跨患者的汇聚性T细胞受体（TCR）应答。基于这些发现，研究人员开发了一个名为TFiT（Tumor-reactive Features in T cells）的15基因转录分类器，该分类器能够高精度地识别骨髓中的肿瘤反应性T细胞。重要的是，TFiT在多个独立队列中成功预测了MM和AML患者对免疫疗法（包括双特异性抗体和免疫检查点阻断）的应答，但对传统化疗的应答无预测价值，这有力地证明了其作为T细胞介导肿瘤控制特异性生物标志物的价值。该研究发表在《Cancer Cell》上。

**主要关键技术方法**

1. **抗原非依赖性功能性筛选**：采用微流控芯片系统，将单个人骨髓T细胞与患者自体肿瘤细胞共培养，通过检测CD137（4-1BB）上调和细胞因子（IFN-γ、IL-2、TNF）分泌，从功能上直接识别肿瘤反应性T细胞，并进行后续的单细胞TCRα/β测序。
2. **HLA-I类免疫肽组学分析**：对来自11例MM患者和6例AML患者的原代肿瘤样本进行HLA-I类免疫沉淀和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，系统鉴定肿瘤细胞表面HLA-I分子呈递的肽段，包括经典和非经典来源的肽段。
3. **单细胞转录组与TCR测序整合**：对20例新诊断MM患者（NDMM）和15例新诊断AML患者（NDAML）的骨髓T细胞进行5′单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞V(D)J测序（scVDJ-seq），并与已发表的泛癌T细胞参考图谱进行整合，实现高分辨率的T细胞表型注释和直接比较。
4. **TFiT转录分类器的构建与验证**：通过对功能鉴定的肿瘤反应性T细胞、病毒特异性T细胞和旁观者T细胞进行差异基因表达分析，筛选出15个特征基因，构建TFiT分类器，并在独立队列中验证其预测免疫治疗应答的能力。

**研究结果**

**1. 鉴定MM和AML患者骨髓中的肿瘤反应性T细胞**
研究人员通过抗原非依赖性功能性筛选，在21例患者（NDMM n=15，AML n=6）的骨髓中鉴定出333个功能性肿瘤反应性T细胞。这些细胞在几乎所有患者中均可检测到，但频率和功能特征存在个体差异。功能验证证实，这些TCRs对自体肿瘤细胞具有选择性激活，而对健康外周血单核细胞（PBMCs）或病毒肽库无反应。

**2. MM和AML中非经典免疫肽组和共享抗原脆弱性**
对11例MM和6例AML患者的HLA-I类免疫肽组分析显示，共鉴定出17,161个独特肽序列。研究发现，经典突变衍生新抗原极为罕见，而肿瘤免疫肽组主要由非经典肽段（如从上游开放阅读框[uORF]、下游开放阅读框[dORF]、长链非编码RNA[lncRNA]和假基因衍生）以及癌症相关抗原（CAA）构成。MM和AML的抗原景观存在系统差异，但同时也鉴定出一部分跨疾病共享的、反复呈递的非经典肽段，表明存在汇聚性抗原加工通路。

**3. 肿瘤特异性TCRs的映射和汇聚性选择**
通过将功能数据与基线BMT转录组整合，研究人员将2,243个T细胞映射回其初始转录状态。研究发现，肿瘤特异性TCRs展现出显著高于病毒或孤儿TCRs的克隆性，并具有与细胞毒性相关的转录状态。此外，通过CDR3序列相似性分析，研究人员鉴定出多个跨患者共享的汇聚性TCR网络，其中一些靶向共享的肿瘤抗原，如CTAG2_86-94，该抗原展示出HLA交叉递呈的潜力。

**4. 保守的转录程序定义骨髓中的肿瘤反应性T细胞**
通过差异基因表达分析，研究人员发现肿瘤反应性BMTs具有保守的细胞毒性效应表型，高表达GZMB、GZMH、GNLY、PRF1、NKG7和ZNF683等基因，但缺乏实体瘤TILs中典型的耗竭标志物（如TOX、ENTPD1、PDCD1）。基于此，研究人员构建了TFiT分类器，其在独立验证队列中达到0.895的AUC，优于现有的实体瘤TIL反应性签名。TFiT阳性细胞主要映射到CD8+效应T细胞区室，而非耗竭区室。

**5. 预先存在的肿瘤反应性T细胞与多发性骨髓瘤的临床应答相关**
在NDMM患者接受诱导化疗的前瞻性纵向队列中，研究人员发现，TFiT分类的肿瘤反应性TCRs在治疗后更倾向于持续存在或显著扩增。此外，在治疗前达到完全缓解（CR）的患者中，其骨髓中TFiT阳性细胞的丰度更高。在复发/难治性MM（r/r MM）患者接受BCMA×CD3双特异性抗体（elranatamab）治疗的研究中，同样观察到TFiT阳性细胞在治疗后选择性扩增，且基线TFiT阳性细胞频率高的患者临床应答更好。

**6. 肿瘤反应性T细胞与AML中的免疫治疗应答相关，但与化疗无关联**
在NDAML患者接受标准化疗的队列中，TFiT不能预测化疗应答。然而，在复发/难治性AML（r/r AML）患者接受阿扎胞苷（AZA）联合纳武利尤单抗（Nivolumab）免疫治疗的II期临床试验（AARON trial）中，TFiT阳性细胞在基线时即可检测到，并在临床应答者中特异性扩增，且扩增程度与肿瘤负荷减少和临床应答显著相关。同样，在AML患者接受异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后，较低的TFiT评分与早期复发相关。

**总结与讨论**

本研究系统性地定义了MM和AML中肿瘤反应性T细胞的保守程序和特异性，并成功识别了预测免疫治疗应答的转录相关物。研究人员得出结论，骨髓中的肿瘤反应性T细胞处于一种“潜伏胜任”状态，即它们具备细胞毒性的转录能力，但体内并未主动进行持续的肿瘤清除。这一发现为解释为何免疫检查点阻断（ICB）在MM和AML中疗效有限，而双特异性T细胞衔接器（bsAb）、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和异基因移植等疗法效果显著提供了机制性依据：这些疗法绕过了内源性T细胞启动的障碍，直接激活或提供了功能性的T细胞。TFiT作为特异性的T细胞介导肿瘤控制生物标志物，而非通用的预后标志物，其应用价值在与化疗的对比中得到了明确验证。该研究不仅为理解骨髓恶性肿瘤的内源性抗肿瘤免疫提供了资源，也为开发针对这类疾病独特免疫生物学的免疫疗法提供了一个框架。