清除未成熟脐血NK细胞亚群逆转吞食作用驱动的CAR-NK细胞功能障碍

《Cancer Cell》：Depletion of an immature cord blood NK subset reverses trogocytosis-driven CAR NK dysfunction

　　

同种异体CAR工程化NK细胞能够实现可扩展的现货型治疗，但供体异质性仍然是实现一致效力的主要障碍。基于研究人员在脐血来源的CAR-NK细胞方面的临床经验，研究人员识别出一种与不良预后相关的未成熟CD16^?CD161^?双阴性（DN）NK亚群。在CAR工程化之后，DN来源的NK细胞仍然功能低下，但却表现出过度吞食作用（TROG），积累高水平的同源抗原，并形成一种产品内部的吞食性抗原汇（TAS），从而将CAR的识别从肿瘤靶点转移开，并在产品内部促进靶向性的非肿瘤相互作用。因此，暴露于TAS的CD16⁺CD161⁺双阳性（DP）效应细胞经历持续激活、代谢应激、自相残杀、活力降低、程序性细胞死亡和渐进性耗竭，最终导致持久性和肿瘤控制能力受损。制造前去除DN细胞可消除TAS，并在血液和实体肿瘤模型中恢复DP的抗肿瘤活性。总之，这些发现定义了由供体亚群驱动的CAR-NK细胞功能障碍机制，并提供了一种改善抗肿瘤效力的制造策略。

**论文解读：清除未成熟脐血NK亚群逆转吞食作用驱动的CAR-NK细胞功能障碍**

**研究背景与科学问题**

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得了变革性成就，但其广泛临床应用仍受限于制造可扩展性、高昂成本及毒性管理。自然杀伤（NK）细胞作为同种异体平台具有显著优势，无需人类白细胞抗原（HLA）配型即可输注，实现真正的“现货型”治疗，且无移植物抗宿主病风险。然而，供体间的差异性成为标准化进程中的主要障碍，劣质来源的细胞可导致产品扩增、体内持久性及肿瘤控制效果的不一致。研究人员此前报道了一项I/II期临床试验，使用脐血（CB）来源的CAR19/IL-15 NK细胞治疗CD19阳性B细胞淋巴恶性肿瘤患者，显示出临床活性且毒性有限。由于每位患者接受的产物均来自不同脐血单位的独立制造，这为区分优质与劣质供体、定义驱动这些供体效应的潜在生物学机制提供了直接机会。

**研究内容与核心结论**

本研究发现，CAR-NK细胞的性能强烈受制于脐血中由CD16和CD161表达定义的两个NK细胞亚群间的平衡，并识别出一种改善劣质脐血供体的可行策略。具体而言，未成熟CD16^?CD161^?双阴性（DN）NK亚群衍生的CAR-NK细胞作为直接肿瘤杀伤细胞功能低下，但表现出过度的吞食作用（TROG），在细胞表面积累高水平的同源肿瘤抗原，形成产品内部的“吞食性抗原汇”（TAS）。TAS将CAR的识别从肿瘤靶点转向产品内部，导致CD16⁺CD161⁺双阳性（DP）效应细胞经历持续激活、激活诱导的细胞死亡（AICD）、自相残杀及功能耗竭，最终削弱其抗肿瘤持久性与控制能力。通过制造前去除DN细胞，可消除TAS并恢复DP细胞的抗肿瘤活性，在多种血液及实体瘤模型中均得到验证。该研究发表在《Cancer Cell》，阐明了供体亚群驱动的CAR-NK细胞功能障碍新机制，并为提升CAR-NK细胞疗法的效力一致性与产品持久性提供了切实可行的制造干预策略。

**主要关键技术方法**

研究人员利用质谱流式技术（CyTOF，飞行时间细胞计数法）对33例临床试验患者的脐血来源NK细胞进行单细胞聚类分析，结合临床响应数据识别关键亚群。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对制造前的脐血NK细胞及扩增后的DP/DN来源NK细胞进行转录组学分析，并整合表面抗体标记（ADT）进行多模态单细胞图谱构建。采用CRISPR-Cas9基因编辑技术破坏关键细胞毒性介质（GZMB、PRF1、IFNG）以验证功能机制。利用纳米孔网格单细胞成像（TIMING）平台进行实时杀伤动力学分析，并构建Raji淋巴瘤和SKOV3卵巢癌异种移植小鼠模型（来自NSG小鼠）进行体内药效评估。样本队列来源于MD Anderson脐血库（IRB批准方案Lab04-0249）。

**研究结果**

**1. 扩增前脐血NK亚群组成决定CAR19/IL-15疗效和临床结局**
通过CyTOF对未处理供体脐血NK细胞进行谱系分析，发现响应者的脐血单位富含成熟、高细胞毒性的C1-1簇（CD16⁺CD161⁺，即DP亚群），而非响应者则富含未成熟、低表达关键受体的C1-5簇（CD16^?CD161^?，即DN亚群）。较高的DP/DN比值与更高的响应率和更长的生存期显著相关。

**2. 转录组学分析定义未成熟和效应脐血NK细胞状态**
scRNA-seq鉴定出五个细胞簇，其中CBNK-C1（DN）细胞表达发育分化相关基因（如RORA、RUNX1），但低表达典型NK细胞受体和细胞毒性分子；CBNK-C4（DP）细胞则表达高水平的细胞毒性效应分子（PRF1、GZMA等），且无耗竭标志物升高。拟时序分析显示从CBNK-C1向CBNK-C4和CBNK-C5的发育轨迹。

**3. 单细胞分析揭示DP和DN亚群扩增后的不同功能程序**
从流式分选的DP/DN亚群分别扩增后，DP来源细胞（DPEX）富集于细胞毒性和激活状态，保留成熟的受体和膜近端信号网络；而DN来源细胞（DNEX）则呈现更大异质性，依赖细胞因子驱动和内涵体先天感知通路，且部分细胞表达多种免疫检查点受体，提示早期耗竭样程序。

**4. DN来源CAR-NK细胞即使经体外扩增仍表现功能低下**
DN来源CAR19/IL-15 NK细胞增殖缓慢，代谢适应度降低（糖酵解和线粒体氧化能力受损），抗原刺激后多功能性减弱，重复肿瘤攻击后杀伤能力下降。DP来源细胞在持续肿瘤接触中表现出强效抗肿瘤活性，但伴随AICD迹象（活化的caspase-8、Fas/FasL表达）和细胞焦亡（活化的caspase-1）。

**5. DN来源细胞形成TROG-抗原汇，在群体水平抑制CAR-NK细胞功能**
DN来源CAR-NK细胞通过增强的TROG积累更多tCD19，形成TAS，将DP效应细胞的CAR识别从肿瘤靶点转向TROG阳性同胞细胞，促进自相残杀、AICD和耗竭。混合培养中，DN比例增加会剂量依赖性地抑制DP介导的肿瘤清除，并导致CAR-NK细胞持久性降低。

**6. 含有DN来源NK细胞的CAR-NK细胞产品体内抗肿瘤活性受损**
在Raji异种移植模型中，仅输注DP来源细胞实现持久抗肿瘤活性，而混合DN细胞（4:1 DP/DN）的产品无法控制肿瘤进展，体内DP来源效应细胞选择性丢失，DN来源细胞主导循环。

**7. 高TROG-抗原负荷在体内驱动DP来源CAR-NK细胞的自相残杀和耗竭**
CyTOF分析显示，DN来源细胞在与DP共输注时积累高TROG-抗原，而DP细胞则转向功能障碍表型，表现为CD16、CD161和关键衔接分子丢失，免疫检查点共表达增加，最终进入耗竭状态。

**8. 去除DN亚群可恢复脐血CAR-NK细胞体内抗肿瘤活性**
从低DP/DN比值的脐血供体制造CAR-NK细胞时，去除DN细胞（CAR NKDN?DEP）可显著改善体内肿瘤控制、CAR-NK细胞持久性和生存期。在Raji淋巴瘤和SKOV3卵巢癌模型中均验证了这一效果，甚至接近保护性AI-CAR工程化产品的效力。

**结论讨论与总结**

**讨论总结：** 本研究证明，CAR-NK细胞性能受脐血中未成熟DN亚群含量的强烈影响。DN来源细胞功能低下，但通过过度TROG形成TAS，将DP效应细胞拉入自相残杀和激活诱导的耗竭，从而在群体层面破坏产品效力。制造前去除DN亚群提供了一种简单、可扩展的干预策略，以改善产品一致性；限制TAS形成的策略（如优化起始材料组成或CAR回路设计）可进一步增强CAR-NK细胞的效力和持久性。

**研究结论：** （翻译原论文结论部分）总之，研究人员将DN亚群含量定义为CAR-NK细胞产品失败的主要驱动因素，并确立了TAS介导的抗原再分布作为一种群体水平机制，将TROG与自相残杀、DP细胞耗竭和效力丧失联系起来。DN去除提供了一种实用且可扩展的干预措施，以改善产品一致性。更广泛地说，限制TAS形成的策略，无论是通过起始材料组成还是CAR回路设计，都可能进一步增强CAR-NK细胞的效力、持久性和治疗功效。