PD-1阻断后肿瘤浸润浆细胞谱系分析揭示肿瘤特异性抗体

《Cancer Cell》：Tumor-infiltrating plasma cell profiling after PD-1 blockade reveals tumor-specific antibodies

　　

肿瘤浸润B细胞（TIL-Bs）在免疫检查点阻断背景下塑造抗肿瘤反应中的作用仍不完全清楚。在此，研究人员分析了接受新辅助PD-1阻断治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者切除肺肿瘤中的体液免疫反应。研究人员发现，肿瘤协调形成含有CD138⁺浆细胞的三级淋巴结构（TLS），并从中利用表现出体细胞高频突变和类别转换的B细胞受体（BCRs）克隆出重组单克隆抗体（mAbs）。数种mAb结合癌细胞特征性的细胞表面瓜氨酸化蛋白。以先导候选抗体（PC-1）的可溶性链片段可变区（scFv）重定向的嵌合抗原受体（CAR）T细胞在体内特异性靶向肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞，且无脱靶活性。此外，在荷瘤小鼠中敲除瓜氨酸化酶PADI2可消除对PC-1的反应性以及CAR介导的细胞毒性杀伤。研究人员的结果提示肿瘤浸润浆细胞具有治疗潜力，可被用于癌症治疗。

**论文解读**

**一、研究背景与问题**
肿瘤浸润B细胞（TIL-Bs）在抗肿瘤免疫中发挥抗原呈递、T细胞功能调节及抗体分泌等多重作用，但其在免疫检查点阻断（如PD-1阻断）中的具体角色尚不完全清楚。现有证据表明，PD-1/PD-L1阻断可影响B细胞反应，促进三级淋巴结构（TLS）成熟，且肿瘤内CD138⁺浆细胞数量的增加与非小细胞肺癌（NSCLC）患者接受PD-1阻断后的良好临床结局相关。然而，这些浸润浆细胞产生的抗肿瘤抗体及其抗原特异性、治疗潜力仍缺乏系统研究。此外，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在实体瘤（包括NSCLC）中面临肿瘤特异性抗原筛选困难及肿瘤微环境免疫抑制等挑战。因此，研究人员利用新辅助PD-1阻断治疗后的NSCLC肿瘤标本，旨在通过单细胞转录组与B细胞受体（BCR）测序联合分析，挖掘肿瘤浸润浆细胞来源的抗体，并评估其作为CAR T靶向策略的可行性。该研究发表于《Cancer Cell》。

**二、主要技术方法**
研究人员从TOP1501临床试验（NCT02818920）中获取接受新辅助帕博利珠单抗治疗的NSCLC患者的切除肿瘤标本。关键技术包括：采用CODEX（co-detection by indexing）多重免疫荧光分析TLS密度与细胞组成；对CD138或CD19富集的肿瘤浸润B细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）及配对BCR测序；基于测序数据克隆重组单克隆抗体（mAbs）；通过免疫沉淀联合质谱（IP-MS）鉴定抗体靶抗原；利用表面等离子共振（SPR）测定亲和力；解析apo-PC-1 Fab的X射线晶体结构；构建PC-1 scFv来源的CAR T细胞，并在NSG小鼠异种移植模型及免疫健全同源小鼠模型（UPK10卵巢癌模型）中评估抗肿瘤活性与毒性。

**三、研究结果**

**1. PD-1阻断后NSCLC肿瘤中浆细胞积累**
对三名患者（001、004、006）的术后标本进行CODEX分析，发现治疗后肿瘤形成大量成熟TLS，内含CD138⁺CD38⁺抗体分泌细胞（ASCs），且ASCs广泛分布于肿瘤间质和实质。TLS根据B细胞富集程度和Ki67表达分为未成熟、静止成熟和增殖成熟三类，表明PD-1阻断促进支持B细胞发育的微环境。

**2. 单细胞谱系分析鉴定NSCLC中TIL-B群体**
对7,150个质量过滤后的TIL-B进行scRNA-seq，通过Azimuth扁桃体参考数据集注释出7个主要B细胞簇：幼稚样B、活化幼稚B、增殖B、生发中心（GC）B、记忆B（MBC）、非典型记忆B（AtM B）和ASCs。BCR分析显示，来自GC、MBC、AtM和ASC群体的抗体发生类别转换，且体细胞高频突变（SHM）频率较高。共鉴定出39个共享克隆谱系，表明TIL-B在肿瘤内发生分化和克隆扩增。

**3. 不同TIL-B群体来源抗体的肿瘤反应性**
从两名患者（004、301）中分别生产15个（来自最扩增的ASC克隆型）和29个（来自GC、MBC、AtM及次扩增ASC谱系）重组mAb。免疫荧光检测显示，73%的ASC来源mAb与Calu-6细胞表面结合，52%的其余群体来源mAb与A549细胞表面结合。其中PC-1抗体（来自第004号患者最扩增的ASC谱系，含107个成员）表现出最强的细胞表面结合能力，被选为先导抗体。

**4. 瓜氨酸化波形蛋白是肿瘤抗体的共同靶点**
PC-1结合多种来源的肿瘤细胞系（肺、间皮、卵巢、子宫）。通过IP-MS鉴定到波形蛋白为先导候选抗原，并证实PC-1特异性结合重组瓜氨酸化波形蛋白，而非未修饰波形蛋白，同时结合瓜氨酸化的Hsp90、钙网蛋白及p53，亲和力均为纳摩尔级（KD=1.36×10^-8 M至1.93×10^-8 M）。另外9种肿瘤抗体亦显示对瓜氨酸化钙网蛋白的反应性。

**5. 肿瘤反应性抗体的起源**
PC-1不结合环瓜氨酸肽（CCP），亦不结合临床相关核自身抗原，且在HuProt蛋白微阵列（23,004种蛋白）中仅0.6%蛋白结合Z>3，排除病理性自身反应性。将PC-1回复至胚系序列后，其与瓜氨酸化抗原的结合显著降低，表明该抗体谱系在肿瘤微环境中经体细胞高频突变亲和力成熟。

**6. PC-1表位与结构解析**
PC-1的Fab片段晶体结构（2.2 ?）显示互补决定区（CDR）长度较长（HCDR2为17个氨基酸，HCDR3为15个，LCDR1为17个），富含芳香族和极性残基，可容纳结构多样的表位。表面等离子共振显示PC-1结合p53的核心结构域及钙网蛋白的P结构域，表明其识别共享的构象特征。

**7. 瓜氨酸化波形蛋白在肿瘤细胞及促肿瘤细胞中的表达增加**
PC-1结合新鲜分离的卵巢癌患者肿瘤细胞，而不结合配对正常组织。同时，PC-1结合肿瘤相关巨噬细胞、髓系来源抑制细胞（MDSCs）及耗竭CD4⁺T细胞，以及NSCLC恶性积液中的癌症相关成纤维细胞（CAFs），但不结合健康供者外周血单个核细胞（PBMCs）。

**8. PC-1 CAR T细胞在体内特异性靶向肿瘤细胞和促肿瘤髓系细胞**
携带CD28或4-1BB共刺激域的PC-1 CAR T细胞在体外杀死Calu-6和A427细胞（细胞指数降低60%-92%），在NSG小鼠异种移植模型中控制肿瘤生长。敲除PAD2（瓜氨酸化酶）的A427细胞表面PC-1结合率从82.6%降至6.4%，且CAR T杀伤被消除，证明该活性依赖PAD2介导的瓜氨酸化。在免疫健全的UPK10同源模型中，鼠源化PC-1 CAR T细胞提高生存率，且组织学及血清学检测未发现心、肝、肾、肺、脑等器官毒性，仅肿瘤组织出现广泛脂肪坏死。

**四、讨论与结论**
本研究通过整合单细胞转录组与BCR测序，建立了一个高通量平台，从不同TIL-B群体中分离出肿瘤反应性抗体，并证实这些抗体主要识别瓜氨酸化蛋白（如瓜氨酸化波形蛋白）。PC-1抗体作为先导，其CAR T改造在体内特异性杀伤肿瘤细胞及促肿瘤髓系细胞，且无脱靶毒性。该工作表明肿瘤浸润浆细胞来源的抗体可利用于开发新型肿瘤疗法（如抗体-药物偶联物、CAR T）。研究结论翻译如下：
总之，本研究提供了一个计算分析TIL-B反应的平台，可实现快速、高通量、抗原无关的肿瘤反应性抗体分离，证明了异质性TIL-B群体中存在肿瘤抗原反应性，这些反应是抗肿瘤体液免疫的一部分。更重要的是，鉴定患者来源的单克隆抗体及其同源抗原可能有助于开发新型肿瘤疗法，如抗体-药物偶联物和CAR T细胞，并作为候选肿瘤抗原纳入未来癌症疫苗平台。