METTL3通过激活转录延伸促进细胞周期进程

《Molecular Cell》：METTL3 promotes cell-cycle progression via activation of transcriptional elongation

　　

转录延伸在有丝分裂进入时经历广泛重塑，然而延伸控制如何整合到核心细胞周期激酶网络中仍不清楚。在此，研究人员将m⁶A甲基转移酶METTL3鉴定为哺乳动物细胞中有丝分裂激酶CDK1的直接底物。CDK1依赖性METTL3在Ser43位点的磷酸化在有丝分裂进入时急剧诱导，并促进非编码RNA 7SK的m⁶A甲基化，导致正性转录延伸因子b（P-TEFb）从抑制性7SK小核核糖核蛋白颗粒（snRNP）复合物中释放。该m⁶A/7SK/P-TEFb轴的激活促进了全基因组范围的RNA聚合酶II清除，并支持及时的有丝分裂进程。METTL3 Ser43的内源性突变或7SK甲基化的破坏会损害延伸动力学、延迟有丝分裂退出并增加染色体错误分离。这些发现将RNA甲基化整合到CDK1驱动的有丝分裂程序中，并揭示了一种转录延伸与染色体分离保真度相协调的机制。

**论文解读：METTL3通过CDK1依赖性磷酸化协调转录延伸与有丝分裂进程**

**研究背景与问题**
转录延伸是细胞周期进程中关键的调控步骤，确保每个阶段所需基因的及时协调表达。在有丝分裂起始时，全局转录起始被广泛抑制，导致活跃延伸的RNA聚合酶II（RNAPII）发生“run-off”，随后转录活性停止。该过程与G2/M转变期间染色质重塑和RNAPII从染色质上移除密切相关，对于染色体凝集和分离至关重要。正性转录延伸因子b（P-TEFb）由CDK9和细胞周期蛋白T组成，是该调控网络的核心。P-TEFb通过磷酸化RNAPII的C末端结构域（CTD）以及负性延伸因子NELF和DSIF，释放RNAPII从启动子近端暂停状态，从而实现有效延伸。早期有丝分裂中，P-TEFb的激活是将暂停RNAPII转化为延伸形式所必需的，随后RNAPII能够清除基因体并从染色质解离，从而强制执行精确染色体分离和有丝分裂进入所需的转录关闭。这些过程的紊乱可导致RNAPII异常滞留、有丝分裂期间基因表达异常以及细胞分裂缺陷。N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是真核mRNA中最丰富的内部修饰，其催化复合物METTL3/METTL14参与调控RNA稳定性、miRNA加工、RNA剪接和翻译，进而调节细胞功能，如减数分裂、细胞增殖和胚胎干细胞分化，以及癌症等病理生理状态。尽管研究人员先前已证明生长因子通过MAPK通路诱导ERK依赖性METTL3 Ser43磷酸化，促进7SK m⁶A甲基化并释放P-TEFb，从而在间期调控转录延伸，但METTL3是否整合到内在细胞周期调控网络中仍不清楚。特别是，METTL3是否参与协调转录关闭和染色体分离的核心有丝分裂激酶级联反应尚未明确。鉴于有丝分裂进入时RNAPII动力学的广泛重塑，研究人员假设METTL3可能作为细胞周期调控的效应器，将RNA甲基化与有丝分裂进程联系起来。

**研究内容与结论**
本研究确立了METTL3作为有丝分裂激酶CDK1的直接效应器，并揭示了一种RNA甲基化依赖机制，该机制协调转录延伸与细胞分裂。研究人员发现，有丝分裂进入时METTL3 Ser43位点的磷酸化促进7SK m⁶A甲基化、抑制性HEXIM1的置换以及P-TEFb的释放，从而在早期有丝分裂期间实现全基因组RNAPII清除。内源性S43突变破坏延伸动力学、延迟有丝分裂退出并损害染色体分离保真度。这些表型可通过HEXIM1耗竭得到挽救，并通过甲基化缺陷的7SK重现，表明受调控的7SK修饰是这些有丝分裂缺陷的基础。这些发现将m⁶A RNA修饰机制整合到核心CDK1控制的有丝分裂网络中，并揭示了一种转录延伸与染色体分离同步化的机制。论文发表在《Molecular Cell》。

**关键技术方法**
研究人员使用CRISPR-Cas9技术生成内源性METTL3 S43A和S43E突变细胞系（HeLa细胞），以及通过CRISPRi抑制内源性7SK并用野生型或甲基化缺陷型7SK回补的细胞系。利用质谱（DIA-MS）和磷酸化蛋白质组学分析METTL3磷酸化状态和修饰。通过mNET-seq（哺乳动物细胞天然延伸转录本测序）评估全基因组RNAPII Ser2磷酸化水平的延伸动力学。采用活细胞成像、流式细胞术和免疫荧光分析有丝分裂进程和染色体分离。此外，通过体外激酶实验验证CDK1直接磷酸化METTL3。

**研究结果**

**METTL3是细胞有效增殖和有丝分裂进程所必需的**
METTL3耗竭（使用两种独立shRNA）导致HeLa和MDA-MB-231细胞G2/M期积累。回补野生型METTL3可恢复细胞周期分布，而催化失活突变体（D395A）无法挽救，表明METTL3催化活性（即m⁶A沉积）是有效有丝分裂进程所必需的。质谱和磷酸化蛋白质组学分析显示，在nocodazole处理4小时后，METTL3 Ser43位点磷酸化大幅增加（从间期<10%升至约70%），且pS43占检测到的磷酸化肽段的95%，表明该修饰是有丝分裂的主要事件。

**CDK1在有丝分裂进入时磷酸化METTL3**
用CDK1抑制剂RO-3306处理可完全消除nocodazole诱导的METTL3 Ser43磷酸化，而CDK7、CDK9、ATM或ERK抑制剂无显著效果。CDK1 siRNA敲低同样降低pS43水平。体外激酶实验证实纯化的CDK1/细胞周期蛋白B直接磷酸化METTL3 Ser43，表明METTL3是CDK1的底物。

**METTL3 Ser43磷酸化是及时有丝分裂进程和RNAPII清除所必需的**
内源性S43A突变细胞（CRISPR-Cas9）无法诱导Ser43磷酸化，但METTL3表达正常。S43A细胞增殖减慢，G2/M期积累，活细胞成像显示有丝分裂退出延迟约2小时。相反，磷酸模拟突变S43E细胞G2/M期比例降低，表明加速了G2/M过渡。mNET-seq分析显示，野生型细胞在nocodazole处理后RNAPII Ser2磷酸化水平降低（提示清除），而S43A细胞类似CDK9抑制（flavopiridol）表型，RNAPII清除受损。S43A突变不影响BRD4表达，排除替代机制。

**HEXIM1耗竭功能性地挽救METTL3磷酸化缺失导致的有丝分裂缺陷**
根据模型，S43A细胞中METTL3无法磷酸化，导致P-TEFb被7SK/HEXIM1复合物扣押。HEXIM1敲低（两种shRNA）可部分恢复S43A细胞的增殖缺陷，并降低G2/M积累至接近野生型水平，表明强制释放P-TEFb可绕过METTL3磷酸化需求。

**直接干扰7SK甲基化重现METTL3 S43A相关有丝分裂缺陷**
通过CRISPRi抑制内源性7SK，并用野生型或甲基化缺陷型（Δm⁶A）7SK回补。甲基化缺陷型7SK导致G2/M期显著积累，与S43A细胞表型一致，表明7SK m⁶A甲基化是METTL3/7SK/P-TEFb轴功能所必需的。

**METTL3/m⁶A轴破坏损害染色体分离**
METTL3耗竭显著增加中期染色体排列错误和后期滞后染色体频率。S43A突变同样增加染色体错分离，而HEXIM1敲低可挽救这些缺陷。甲基化缺陷型7SK也导致染色体错分离增加，表明该轴对于维持有丝分裂保真度至关重要。

**总结讨论**
本研究将METTL3依赖性RNA甲基化定位为有丝分裂进程的调控组分。CDK1磷酸化METTL3 Ser43，促进7SK m⁶A甲基化，释放P-TEFb，从而在早期有丝分裂中实现RNAPII高效清除，支持及时的有丝分裂和染色体分离保真度。该机制将RNA修饰整合到内在细胞周期激酶级联中，与间期ERK信号通路不同，METTL3在此作为CDK1驱动有丝分裂程序的直接底物。Ser43磷酸化作为调控层而非二元开关，精细调节转录清除以保障分裂准确性。研究局限性包括：该修饰相对于其他CDK1底物的贡献未知；未涉及其他有丝分裂过程；主要实验在HeLa、U2OS和MDA-MB-231细胞中进行，需在其他细胞类型中验证。

**研究结论翻译**
这些发现将METTL3依赖性RNA甲基化定位为CDK1驱动有丝分裂程序的调控组分。METTL3在此不仅是信号响应性转录调节因子，更是有丝分裂底物，其磷酸化将RNA修饰整合到内在细胞周期激酶网络中。通过在有丝分裂进入时促进7SK甲基化和受控的P-TEFb释放，METTL3协调转录延伸动力学与染色体分离保真度。该磷酸化事件并非二元开关，而是作为调控层精细调节转录清除，以保障分裂准确性。这些发现揭示了一种先前未被认识的机制，即RNA修饰酶直接与核心细胞周期控制机制对接，以确保有丝分裂稳健性。