尽管使用了抗真菌强化培养基，仍发生供体传播性念珠菌性角膜炎的病例

《Eye Banking and Corneal Transplantation》：A Case of Donor-Transmitted Candida Keratitis Despite Antifungal Fortified Storage Media

　　目的：报道一例尽管供体组织在添加了两性霉素B的培养基中保存，但在穿透性角膜移植术后仍发生真菌性角膜炎并继发眼内炎的病例。方法：报告一例供体传播的真菌性角膜炎病例，尽管供体组织在添加了两性霉素B的培养基中保存，但仍发展为真菌性眼内炎。结果：一名51岁的女性因反复出现的颗粒状角膜营养不良，右侧眼睛接受了穿透性角膜移植术，术后供体角膜边缘培养出白色念珠菌。两周内，该眼出现疑似真菌感染的迹象，且尽管进行了经验性抗真菌治疗，感染仍然存在。再次进行穿透性角膜移植时使用了无菌移植片，但真菌性角膜炎再次发作并发展为真菌性眼内炎。最终，该患者因感染相关并发症而出现持续性视力丧失。结论：我们报道了一例尽管供体组织在添加了两性霉素B的培养基中保存，但仍发生供体传播的真菌性角膜炎并继发眼内炎的病例。角膜移植后的感染性角膜炎是一种罕见的并发症，发病率在0.02%到11.9%之间。真菌性角膜炎和眼内炎在每10,000例角膜移植手术中约有1.4例发生，可能导致严重的视力损害。白色念珠菌是角膜移植后真菌性角膜炎的最常见病因，有一项回顾性研究指出这类病例中有16%由该菌引起。在体外实验中，将供体移植片保存介质中的两性霉素B浓度提高到2.50微克/毫升可抑制真菌生长，但这一措施的临床效果尚不确定。因此，是否将供体角膜保存在添加了抗真菌药物的培养基中，需根据外科医生和医院的决策来决定。在本报告中，我们描述了这样一例病例：尽管供体移植组织在添加了两性霉素B的培养基中保存，但在穿透性角膜移植术后仍发生供体传播的真菌性角膜炎并继发眼内炎。病例报告：一名51岁的假性晶状体眼女性，患有原发性开角型青光眼和颗粒状角膜营养不良，此前已接受过穿透性角膜移植术，因移植角膜上反复出现颗粒状沉积物导致慢性视力下降，被转诊至我处就诊。她的右眼再次接受了穿透性角膜移植术，手术过程顺利，未出现任何并发症。有趣的是，外科医生发现供体角膜边缘不透明、有弹性，且难以缝合。该供体移植片来自一名43岁的患者，该患者因严重糖尿病和高血压并发症去世。供体角膜在保存前已在4摄氏度下冷藏了6小时40分钟，从死亡到保存的时间为19小时，从保存到手术的时间为7天。在这7天内，供体角膜一直保存在添加了2.50微克/毫升两性霉素B的培养基中。受体患者没有免疫抑制风险因素，术后接受了常规的莫西沙星滴眼液和醋酸泼尼松龙滴眼液治疗。术后两天，供体角膜边缘培养出了白色念珠菌（见表1），于是开始逐渐减少皮质类固醇滴眼液的使用，同时开始使用两性霉素B滴眼液和多西环素口服。尽管如此，供体角膜上仍出现了新的内皮细胞浸润，并伴有前房积脓，表明仍有活跃的微生物繁殖。于是给患者增加了伏立康唑口服，以进一步加强抗真菌治疗。在初次手术14天后，再次进行了穿透性角膜移植术，此次同时进行了前房冲洗，向眼前房注入两性霉素B和伏立康唑，还在角膜基质层和玻璃体中注入了两性霉素B。第二个供体角膜同样在添加了两性霉素B的培养基中保存，其边缘培养结果为阴性。表1. 微生物学检测总结检测日期检测项目组织来源处理时间结果2021年4月7日厌氧培养第一个供体角膜边缘2天少量白色念珠菌2021年4月7日真菌培养第一个供体角膜边缘2天带假菌丝的出芽酵母2021年4月21日组织病理学检查第一个角膜移植物8天酵母和真菌菌丝集中在后部基质层和Descemet膜上2021年4月21日真菌培养第一个角膜移植物7天阴性2021年7月23日真菌培养血液28天阴性2021年7月27日真菌培养前房冲洗液7天阴性2021年7月27日真菌培养前房冲洗液28天阴性2021年7月29日厌氧培养第二个角膜移植物7天阴性2021年7月29日真菌培养第二个角膜移植物9天阴性2021年7月29日真菌培养第二个移植物背后的角膜膜9天阴性2021年7月29日真菌培养玻璃体液28天阴性通过对第一个移植物进行的组织病理学检查，可见在Periodic Acid-Schiff染色下，酵母和真菌假菌丝集中在后部基质层和Descemet膜上（图1）。在周边区域还发现了罕见的Grocott-G?m?ri甲胺银阳性酵母形态。真菌培养则发现了带假菌丝的出芽酵母，最终鉴定为白色念珠菌，从而确诊为念珠菌性角膜炎。图1. 用PAS染色的组织病理学切片，显示后部角膜基质层局部受损，以酵母形态（黑色箭头）和假菌丝（蓝色圆圈）为中心形成微脓肿。放大倍率为20倍。DM：Descemet膜；PAS：Periodic Acid-Schiff。此后，患者开始使用两性霉素B滴眼液和莫西沙星滴眼液，以及多西环素口服。还开了8周的伏立康唑口服疗程。在这个治疗方案下，第二个移植片状况稳定，但后来出现了瞳孔膜，于是在术后第9周进行了钕掺杂钇铝石榴石囊膜切开术治疗。术后第14天检查时，发现供体移植片的下三分之一区域及前房细胞上有新的内皮细胞浸润（图2）。于是增加了两性霉素B滴眼液的用量，并重新开始口服伏立康唑。随后的共聚焦显微镜检查显示，供体移植片基质层深处存在真菌孢子（图3）。图2. 二次角膜移植术后第14天所见的下方内皮细胞斑块。图3. 共聚焦显微镜检查显示供体移植片基质层深处的真菌孢子。这些新发现提示真菌性角膜炎可能向后扩展，于是患者被收入医院，接受静脉注射两性霉素B治疗。住院期间，患者还接受了角膜基质层、眼前房和玻璃体内的两性霉素B注射。进行了血液培养，28天后结果为阴性。虽然开始了静脉注射两性霉素B的治疗，但由于担心可能出现药物过敏，后来认为只是血管迷走反应，所以提前终止了治疗。尽管加强了局部和全身的抗真菌治疗，但仍出现了新的前房积脓和前房出血（图4）。第二天，患者立即接受了紧急的前房冲洗术，向眼前房注入两性霉素B。手术中发现，角膜后部存在弥漫性内皮细胞斑块，角膜、虹膜和供体移植片出现纤维性新生血管，同时还有前房和玻璃体出血。图4. 出院后出现的新前房积脓和前房出血。术后第一天，B扫描显示玻璃体中有许多大的中央性和小的周围性高回声混浊，提示由于顽固性真菌性角膜炎向后扩散而引发了真菌性眼内炎。鉴于此情况，第二天就安排了紧急手术，结合穿透性角膜移植术、膜溶解术、平面玻璃体切割术以及玻璃体内注射两性霉素B。手术进展顺利，术中观察到的视网膜浸润更支持眼内炎而非反应性炎症的诊断。给予了静脉注射两性霉素B，以及眼前房和玻璃体内的两性霉素B和伏立康唑注射。第三个供体角膜也在添加了两性霉素B的培养基中保存，其边缘培养结果为阴性。术后，患者继续使用两性霉素B滴眼液和莫西沙星滴眼液治疗。在接下来的2个月里，患者在使用抗组胺药预处理后，接受了两次玻璃体内和角膜基质层内的两性霉素B注射，以及一次静脉注射两性霉素B。对第二次移除的角膜进行组织病理学检查，未发现真菌结构或角膜后膜。从这次手术中取出的玻璃体样本的术中培养也为阴性。患者住院期间的血液培养以及之前的前房冲洗液培养也为阴性。由于各项微生物学检测均为阴性，且后续复查时角膜状况良好，因此在首次角膜移植术后5个月，该患者被认为已无感染。在接下来的3年里，该患者出现了与最初感染相关的诸多并发症，包括由于前房内形成纤维性膜和粘连而引发的闭角型青光眼，进而需要前房重建、青光眼引流管植入术以及二极管激光睫状体光凝术。此外，她还出现了低眼压性黄斑病变和脉络膜积液综合征，需要向前房注入粘弹性物质以及调整引流管以防止低眼压进一步加重。她那只做过手术的眼睛视力依然很差，最佳矫正视力仅为20/400，还存在低眼压现象，且脉络膜会出现反复折叠，但并未出现萎缩性变化。我们联系了眼库，想了解那块供体组织的去向。原来，在我们诊断出真菌性角膜炎之前，它已经在另一家机构被用于穿透性角膜移植术。那位进行移植手术的外科医生报告称，供体角膜边缘培养出了白色念珠菌，而且移植片上还有“斑块状”病变，术后并未如预期那样消退。这些因素，再加上常见的供体角膜边缘培养阳性结果，使得那位外科医生出于谨慎考虑，将移植片取出。此后没有再出现活动性真菌感染的报告；取出的移植片上也没有微生物生长，组织病理学检查也未发现真菌成分。讨论：这是一例不寻常的病例，尽管供体组织在添加了抗真菌药物的培养基中保存，但仍发生了供体传播的白色念珠菌性角膜炎。在体外实验中，向供体移植片保存介质中添加两性霉素B确实能够降低白色念珠菌的污染率。然而，目前还没有研究评估这种处理方式与术后真菌性角膜炎发生率之间的关系。Optisol（宝洁公司生产，位于加利福尼亚州尔湾市）是美国最常用的供体移植片保存介质，其配方中包含抗生素，但不含抗真菌药物。2010年，美国眼库协会成立了一个小组，专门研究在Optisol中添加抗真菌药物的可行性。该小组确认了角膜移植术后真菌感染发病率的上升趋势，但由于缺乏关于疗效、安全性和成本效益的充分证据，当时并未建议在培养基中添加抗真菌药物。由于美国眼库协会没有给出明确指导，目前关于是否在供体移植片保存介质中添加抗真菌药物并没有统一的标准，实际操作方式因不同外科医生的选择而异。有一些研究支持在培养基中添加两性霉素B，认为其具有良好的抗真菌效果、出色的短期安全性，而且每块供体移植片的添加成本仅为3.45美元到44.39美元。同时，这些研究还估计，治疗角膜移植术后真菌感染的费用在21,113美元到34,850美元之间。不过，也有人指出，由于缺乏体内和临床数据、上述成本分析存在缺陷，以及美国现有的供体移植片保存方式本身就存在较高的感染风险，因此难以广泛采用在培养基中添加两性霉素B的做法。尽管如此，角膜移植术后真菌性角膜炎和眼内炎的发病率仍然很低，每10,000例角膜移植手术中仅有1.4例。2020年，一群角膜专家共同撰写了一份关于供体移植片保存介质强化处理的综述，文中指出“……仍有许多问题尚未得到解答……”，“……在建议改变标准操作流程之前，还需要进行更大规模的验证研究。”本例中，尽管供体组织在添加了抗真菌药物的培养基中保存，但在穿透性角膜移植术后仍发生了白色念珠菌性角膜炎并继发真菌性眼内炎，这一案例说明了供体传播的真菌性角膜炎的可能性，同时也凸显了有必要开发其他预防措施，以降低角膜移植术后发生真菌性角膜炎的风险。虽然从理论上讲，在供体移植片保存介质中添加抗真菌药物可以降低真菌污染的风险，但本例也暴露出了其局限性，这进一步强调了需要开发新的预防措施，尤其是在角膜移植术后需要使用类固醇的情况下。诸如改进术前筛查方案或研发更先进的抗真菌药物之类的创新措施，或许有助于降低真菌感染的风险。此外，更好地了解与宿主相关的风险因素，比如眼球表面完整性，也可能有助于解释为什么有些患者在采取了预防措施后仍会患上真菌性角膜炎。未来，通过研究这些因素以及抗真菌治疗的最佳时机和剂量，有望建立起更为完善的策略，用于防治角膜移植术相关的真菌性角膜炎。