疾病相关小胶质细胞激活程序的转录调控

《Neuron》：Transcriptional regulation of disease-relevant microglial activation programs

　　

小胶质细胞（microglia），即大脑的先天免疫细胞，能够采用多种与健康和疾病相关的激活状态。小胶质细胞激活的失调发生在多种脑部疾病中，驱动或抑制特定状态可能具有治疗潜力。为了发现小胶质细胞激活状态的调控因子，研究人员在诱导多能干细胞（iPSC）来源的小胶质细胞中进行了CRISPR干扰（CRISPRi）筛选，针对六种小胶质细胞状态的抑制因子和激活因子。研究人员在两种不同的iPSC来源小胶质细胞模型中，在单细胞转录组和细胞表面蛋白质组水平上鉴定了31个调控因子，揭示了相关状态的蛋白质标志物。研究人员对几个多状态调控因子进行了功能表征。ZNF532和PRDM1的敲低驱动疾病相关、富含脂质的特征，并增强吞噬作用，同时对抗原呈递特征表现出相反的效果。DNMT1敲低导致广泛的DNA甲基化丢失，激活干扰素信号传导的负调控因子。这些发现提供了一个框架，用于指导小胶质细胞激活，以选择性富集小胶质细胞激活状态，定义其功能输出，并为未来治疗提供信息。

小胶质细胞（microglia）是大脑实质驻留的免疫细胞，具备高度可塑性，可通过转录激活程序（即激活状态）响应损伤并维持稳态。单细胞技术的进展揭示了微胶质细胞激活状态的多样性，其中疾病相关小胶质细胞（DAM）状态在阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病中显著富集，而脂质丰富、干扰素应答、抗原呈递、趋化因子高表达等状态亦在不同疾病中发挥关键作用。然而，这些激活状态的转录调控机制尚不明确：尽管已有基因调控网络（GRN）预测算法提名了一些候选调控因子，但缺乏直接的功能验证；且多状态调控因子未被全面鉴定。为系统解析这一关键问题，研究人员开展了本研究。

研究人员通过CRISPRi（CRISPR干扰）筛选，在诱导多能干细胞（iPSC）来源的小胶质细胞中鉴定了六种激活状态的调控因子，并利用单细胞转录组学及细胞表面蛋白质组学（CITE-seq）对31个候选因子进行多模态表征，深入研究了ZNF532、PRDM1、STAT2、DNMT1等关键调控因子，揭示了它们对激活状态的特异性调控作用。该研究建立了指导小胶质细胞激活状态定向富集的框架，为神经退行性疾病等脑部疾病的治疗干预提供了新靶点和理论依据。论文发表在《Neuron》。

关键技术方法方面，研究人员主要采用了以下手段：使用CRISPRi（CRISPR干扰）技术进行大规模功能基因组筛选，包括基于荧光激活细胞分选（FACS）的六种激活状态标记物筛选，以及结合单细胞RNA测序（CROP-seq）和细胞表面蛋白质组抗体条形码（CITE-seq）的多模态单细胞筛选。使用了两种iPSC来源小胶质细胞模型：转录因子定向分化模型（iTF-MG）和发育性细胞因子定向分化模型（iMG），并整合了来自人类脑组织样本（UCSF神经退行性疾病脑库等）的ATAC-seq（转座酶可及染色质测序）数据进行交叉验证。此外，还采用了酶促甲基化测序（EM-seq）分析DNA甲基化状态，以及nELISA（纳升级酶联免疫吸附测定）检测分泌蛋白组。

研究结果部分：
**CRISPRi筛选揭示小胶质细胞激活状态的调控因子**：通过FACS-based CRISPRi筛选，针对约1600个转录因子和转录调控因子，分别以CD9（DAM状态）、P2RY12（稳态）、HLA-DMB（抗原呈递）、BODIPY（脂质丰富）、CCL13（趋化因子）和IFIT1（干扰素应答）为标记物，鉴定出大量调控因子。其中CD9筛选发现50个基因敲低后上调DAM标记物，表明多数转录因子主动抑制DAM状态；P2RY12筛选发现80个基因敲低后上调稳态标记物；HLA-DMB筛选发现197个基因敲低后上调抗原呈递标记物，提示DNA甲基化调控与抗原呈递有关；BODIPY筛选发现46个基因敲低后减少脂质负荷；IFIT1筛选发现44个基因敲低后减弱干扰素应答；CCL13筛选仅发现4个基因敲低后上调趋化因子表达。65%的显著调控因子仅影响单个状态，34%影响两个或更多状态，其中DNMT1和PRDM1影响5/6个状态。

**单细胞RNA测序揭示iPSC来源小胶质细胞模型中的不同状态景观**：利用CROP-seq和CITE-seq对31个候选因子进行二次筛选，在iTF-MG和iMG两种模型中进行多模态分析。iTF-MG高表达干扰素应答和趋化因子特征，而iMG高表达DAM、脂质丰富和抗原呈递特征。通过将数据与人类脑源小胶质细胞的26因子框架对齐，验证了两种模型与体内状态的对应关系。

**在转录水平扰动小胶质细胞激活状态揭示复杂状态调控因子**：部分因子敲低后未显著改变全转录组状态特征，表明其可能仅作用于标记物蛋白而非完整状态。许多转录因子在不同模型中产生不同的激活谱，如STAT2敲低在iTF-MG中广泛影响多个状态，而在iMG中仅影响干扰素应答。DAM和脂质丰富mRNA特征在高一致性，但原始FACS筛选显示二者呈相反趋势，提示脂质丰富基因特征与脂滴负荷不一定相关。

**小胶质细胞激活状态与独特的表面蛋白特征相关**：通过CITE-seq分析166种表面蛋白与各状态的相关性，发现干扰素应答状态与趋化因子状态在蛋白水平呈负相关，抗原呈递状态与DAM状态也呈负相关。在人类原代小胶质细胞中验证了这些关系，并确认了ZNF532敲低后DAM相关表面蛋白（CD81、C5AR1、CD86、CD28）上调。

**ZNF532缺失促进DAM特征并限制抗原呈递特征**：在iMG中，ZNF532敲低显著上调DAM和脂质丰富特征，下调抗原呈递特征。差异表达基因与人类AD患者脑组织中的脂质处理状态（MG4）等显著重叠。流式细胞术验证了DAM标记物（CD9、SPP1、TREM2、GPNMB、APOE等）上调，抗原呈递标记物（CD74、HLA-DRB1）下调。

**ZNF532敲低促进突触体和β-淀粉样蛋白的吞噬**：ZNF532敲低后小胶质细胞对β-淀粉样蛋白和人脑源突触体的吞噬能力增强，而溶酶体功能未受损，提示吞噬增加源于摄取增强。

**PRDM1主动抑制DAM和抗原呈递特征**：PRDM1敲低在iMG中上调DAM和脂质丰富特征，且上调抗原呈递特征，与ZNF532相反。差异表达基因与人类AD相关微胶质细胞状态（MG3、MG4、MG5）重叠。流式细胞术验证了DAM和脂质丰富标记物增加，抗原呈递标记物增加，稳态标记物P2RY12降低。

**PRDM1敲低促进β-淀粉样蛋白和突触体的吞噬**：与ZNF532类似，PRDM1敲低后吞噬能力增强，溶酶体功能未受损，提示抗原呈递状态不直接参与该功能。

**STAT2缺失抑制干扰素应答状态**：在iTF-MG中，STAT2敲低主要抑制干扰素应答特征，同时mRNA水平上抗原呈递和脂质丰富特征上调，但蛋白水平上相应标记物变化不一致，凸显多模态分析的重要性。分泌蛋白组分析显示STAT2敲低后趋化因子分泌增加，尽管细胞内CCL13蛋白降低。

**STAT2敲低降低溶酶体酸性**：STAT2敲低导致溶酶体pH指示剂LysoSensor信号降低，组织蛋白酶B活性降低，提示基础干扰素信号维持溶酶体降解能力。

**DNMT1缺失普遍允许激活，但排除干扰素应答状态**：在iTF-MG中，DNMT1敲低广泛上调除干扰素应答和趋化因子外的所有状态特征，干扰素应答特征显著降低。流式细胞术验证了干扰素应答蛋白（IFIT1、IFITM3）降低，脂质丰富和稳态标记物增加，抗原呈递蛋白降低。分泌蛋白组显示DNMT1敲低后趋化因子分泌增加，且对干扰素诱导的细胞因子分泌抑制更强。

**DNMT1敲低后低甲基化激活干扰素应答抑制因子**：全基因组酶促甲基化测序（EM-seq）证实DNMT1敲低导致广泛DNA低甲基化，但干扰素应答基因的启动子亦呈低甲基化。通过整合基因组规模CRISPRi干扰素应答筛选结果，发现低甲基化区域包含多个干扰素负调控因子（如USP18、ISG15）的启动子，且DNMT1敲低后这些基因mRNA水平升高。敲低DNMT1的同时敲低ISG15可部分恢复干扰素应答，表明DNMT1通过抑制ISG15等负调控因子来促进干扰素应答。

在讨论部分，研究人员总结了本研究的关键发现和意义：通过CRISPRi功能基因组筛选鉴定了六种小胶质细胞激活状态的调控因子，并利用多模态分析（mRNA、蛋白、功能）揭示了状态间的复杂关系。研究强调了iPSC来源小胶质细胞模型选择的重要性，并指出激活状态可模块化组合而非互斥。ZNF532和PRDM1的对比研究显示，二者均可驱动DAM和脂质丰富状态，但对抗原呈递状态影响相反，为理解DAM亚型提供了基础。STAT2在微胶质细胞中功能研究较少，其敲低导致溶酶体缺陷，对以干扰素阻断为治疗策略的AD研究具有启示。DNMT1敲低导致DNA低甲基化，通过激活干扰素负调控因子特异性抑制干扰素应答，这与AD患者微胶质细胞中DNA高甲基化现象可能相关。研究还利用Mixscale分析揭示了不同调控因子的剂量-反应关系，并将体外扰动与人类脑源微胶质细胞状态进行了对齐验证。研究结论部分强调：这些数据提供了一个独特的视角来研究微胶质细胞激活状态，多模态分析揭示了mRNA、蛋白和功能之间的不一致性，强烈提示需在mRNA分析之外进行多层面验证，并警示仅基于mRNA表达推断下游功能的局限性。