健康志愿者同时接种新冠病毒疫苗和流感疫苗后的细胞介导及体液免疫反应

《Infants & Young Children》：Cell-Mediated and Humoral Immune Responses to COVID-19 Following Co-Administration of COVID-19 and Influenza Vaccines in Healthy Volunteers

　　背景：新冠病毒疾病（COVID-19）疫苗与流感疫苗联合使用的免疫原性尚未得到充分研究，尤其是在细胞介导的免疫反应方面。本研究旨在评估这种联合使用情况下的细胞介导免疫反应和体液免疫反应。

材料与方法：在这项初步的随机对照试验中，36名健康成年人被随机分配（1:1:1）分别接种流感疫苗、COVID-19疫苗或两者同时接种。细胞介导的免疫反应通过干扰素-γ酶联免疫斑点试验来检测，而体液免疫反应则通过针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2的受体结合域免疫球蛋白G来测定，检测时间分别为接种前以及接种后4周。主要评估指标是接种后免疫反应的几何平均比值，95%置信区间的下限大于0.67被视为非劣效标准。

结果：联合接种组与仅接种COVID-19疫苗组的细胞介导免疫反应几何平均比值分别为1.03（95%置信区间：0.43-2.44）和0.82（95%置信区间：0.52-1.29），体液免疫反应的相应数值也为1.03和0.82，但均未达到非劣效标准。免疫反应的强度分别为1.60（95%置信区间：0.64-4.00）和0.80（95%置信区间：0.41-1.58）。

结论：尽管置信区间低于统计上的非劣效阈值，但接种后的免疫反应总体上是可比的。从反应强度来看，联合接种组的细胞介导免疫反应增强更多，而体液免疫反应则提升较少。这些发现可能支持疫苗联合使用的策略，但仍需更大规模的试验来进一步验证。新冠病毒疾病于2020年3月被世界卫生组织宣布为大流行病，因其在全球范围内迅速传播，导致极高的发病率和死亡率。2023年5月，世卫组织宣布与COVID-19相关的国际公共卫生紧急状态已经结束，这也标志着大流行病的正式终结。不过，COVID-19依然是一种持续存在的疾病，目前正逐渐转变为地方性流行病。通过疫苗接种或既往感染所获得的群体免疫实现了对COVID-19传播的控制。美国疾病控制与预防中心建议每年更新COVID-19疫苗和流感疫苗的接种方案。最新研究表明，流感疫苗可能有助于降低COVID-19的感染率及相关死亡人数。在美国进行的全国性分析显示，老年人接种流感疫苗的比例与COVID-19死亡人数之间存在负相关关系；意大利也观察到了类似的结果。这种保护作用可能是由于交叉反应性免疫所导致的，这类免疫反应是由记忆T细胞介导的，能够引发细胞介导的免疫反应和体液免疫反应。此前有研究发现了COVID-19病毒刺突蛋白的糖链表位与流感病毒表面蛋白之间的交叉反应性抗体，虽然这些抗体不具备中和作用，但可能有助于实现抗体依赖的细胞毒性作用。另一种可能的机制是疫苗具有广泛的免疫效应，能够通过改变先天免疫细胞的基因表达模式来增强已有的免疫能力。另有研究指出，那些同时接种了流感疫苗和肺炎球菌疫苗或仅接种流感疫苗的工作者，其针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2的中和抗体滴度明显更高。还有研究发现，与未接种BNT162b2疫苗的人相比，接种流感疫苗的人体内抗刺突受体结合域抗体的水平更高。此外，还有6项随机对照试验研究了同时接种mRNA COVID-19疫苗和流感疫苗的安全性或免疫原性。所有这些研究都证实了同时接种这两种疫苗是安全的，但关于免疫原性的研究结果则不尽相同。在这6项试验中，有5项评估了体液免疫反应，结果发现同时接种两种疫苗的人体内抗SARS-CoV-2抗体的浓度有所下降。只有2项研究达到了免疫原性方面的非劣效标准。然而，这些研究都没有评估细胞介导的免疫反应。鉴于此前缺乏针对细胞介导的免疫反应的研究，我们开展了这项初步研究，旨在比较同时接种COVID-19疫苗和流感疫苗与分别接种这两种疫苗时的体液免疫反应和细胞介导的免疫反应情况。我们推测，联合接种组的细胞介导免疫反应可能会更强，这或许可以解释之前研究中所观察到的、接种流感疫苗的感染者死亡率较低的现象。如果这一推测得到证实，较强的细胞介导免疫反应可以作为疫苗联合使用的概念验证，展现出这种接种策略潜在的免疫学优势。此外，我们的研究还可能为疫苗联合使用政策提供有益的参考，该政策的实施有望提高疫苗覆盖率并减轻医疗负担。

材料与方法
研究设计及参与者：这项初步的、单盲（仅实验室工作人员不知情）的随机对照试验于2024年3月至4月在宋卡那林医院进行。研究对象为年龄在18至60岁之间、在6个月前已接种过COVID-19疫苗、且在过去6个月内未感染过COVID-19或流感的健康志愿者。患有严重疾病或病情难以控制的人被排除在外。该研究获得了人类研究伦理委员会的批准（编号REC. 66-462-14-1），并且遵循《赫尔辛基宣言》中的原则。

结局指标：主要结局指标是比较联合接种组与仅接种COVID-19疫苗组在接种后针对SARS-CoV-2的细胞介导免疫反应和体液免疫反应情况。次要结局指标包括各组内的免疫反应强度、两组之间免疫反应强度的比较以及不良反应情况。细胞介导的免疫反应和体液免疫反应的替代检测指标分别是干扰素-γ酶联免疫斑点试验和抗RBD免疫球蛋白G水平。这项初步研究并未评估针对流感的特异性免疫反应。

研究流程及随机化：所有志愿者都签署了书面知情同意书，符合条件的参与者被纳入研究。参与者按照1:1:1的比例被随机分组，分组工作是通过R统计软件（版本4.3.2，奥地利维也纳的R基金会）完成的，分组块大小为6。参与者分别被分配到仅接种流感疫苗、仅接种COVID-19疫苗或同时接种两种疫苗的组别，疫苗均通过肌肉注射的方式给予，注射部位可以在不同的手臂上，也可以在同一手臂上，但注射点之间的距离至少要为25.4毫米。在接种前后以及接种后28天，会采集血液样本用于酶联免疫斑点试验和抗体分析。在接种后30分钟内观察即刻出现的不良反应，另外还在接种后7天和28天收集相关报告。

样本量：这项初步研究共纳入36名参与者，每组12人。样本量的确定是基于Julious关于初步研究的指导建议，他认为每个治疗组至少需要12名参与者，这样才能确保在估算效应大小时具有足够的精确度。

统计学分析及非劣效标准：参与者特征和不良反应的发生情况是通过描述性统计方法进行总结的。包括干扰素-γ酶联免疫斑点试验结果和抗RBD IgG水平在内的免疫反应指标，在分析之前先经过对数转换，以此使数据分布趋于正常并稳定方差；为了便于进行对数转换，零值会被替换为1。这种转换方式便于对呈偏态的生物学数据在乘法尺度上进行适当分析，而这正是免疫学测量数据的典型特征。对于主要结局指标，通过计算几何平均比值来比较联合接种组与仅接种COVID-19疫苗组之间的接种后免疫反应差异。几何平均比值是通过将对数转换后的数值均值之差取指数得到的。相应的95%置信区间则是通过对均值对数差异的置信区间取指数得出的。非劣效性评估是依据世界卫生组织关于疫苗临床评估的指南进行的，规定几何平均比值的临界值为1.5倍。如果几何平均比值95%置信区间的下限大于0.67，则认为存在非劣效性。这一标准确保了测试组的免疫反应强度不会比对照组低33%以上，且这一差异是在95%的置信区间范围内。对于次要结局指标，则是通过计算接种前后免疫反应强度的几何平均比值来比较两组内的免疫反应强度变化情况。对于每组内的变化是否具有统计学意义，则使用配对t检验来进行判断。为了确定哪组的免疫反应增强程度更高，还会比较联合接种组与仅接种COVID-19疫苗组的几何平均比值。至于不良反应的发生情况，则根据具体情况选择χ2检验或费希尔精确检验来进行比较。

抗体分析：抗RBD抗体（仅针对武汉株）是通过两步化学发光微粒免疫分析法来检测的（产品名为SARS-CoV-2 IgG，制造商为雅培公司，位于美国伊利诺伊州阿博特帕克）。检测结果以每毫升标准化单位数表示，制造商推荐的临界值为50 AU/mL。AU/mL数值会通过1 BAU/mL=0.142 AU/mL的换算比率转换为世界卫生组织定义的结合抗体单位。

体外干扰素-γ酶联免疫斑点试验：该试验首先从血液样本中分离出外周血单核细胞，然后使用13种肽池（针对武汉株的SARS-CoV-2刺突蛋白及其N端tPA前导序列）对这些细胞进行刺激，肽池的浓度为10 μg/mL。每个试验在3个平行孔中进行，然后在37摄氏度、5%二氧化碳的环境中培养16到18小时。培养结束后，用含有Tween-20的磷酸盐缓冲液清洗培养板，接着在每个孔中加入1 μg/mL的抗IFN-γ检测抗体（7-B6-1-生物素）。再经过2到4小时的培养后，加入1:1000稀释度的链霉亲和素-碱性磷酸酶，继续培养1到2小时，最后使用BCIP NBT-plus显色底物进行显色反应。平板读数则是通过AID自动酶联免疫斑点计数仪（制造商为AID Diagnostika，算法为C，位于德国康斯坦茨）来完成的。检测结果以每106个外周血单核细胞产生的斑点细胞数来表示，这个数值是3个平行孔的平均值，同时会减去未受刺激的阴性对照孔的数值。

结果
研究参与者：2024年3月至4月期间，共有42名成年志愿者接受了资格评估，其中有6人因患有无法控制的慢性疾病而被排除在外。最终有36名符合条件的参与者被随机分为3组，每组12人。参与者的流动情况如图1所示的CONSORT图所示。

参与者的中位年龄为31岁，且没有人患有其他并发症。他们上次接种COVID-19疫苗的时间中位数为87.5周。表1总结了参与者的基线特征和疫苗接种史，其中关于COVID-19疫苗的信息包括之前接种的剂量数、所接种的疫苗类型以及距离上次接种的时间；而关于流感疫苗的信息则包括疫苗类型以及最近一次接种后的时间长度。

表1 总体人群特征
总体（N=36）
流感组（n=12）
COVID-19组（n=12）
联合接种组（n=12）
年龄，中位数[四分位数范围]，岁：31 [25, 41]、39 [25, 41]、28 [25, 38]、29 [25, 41]
性别，人数（百分比）：男性10人（28%）、4人（33%）、2人（17%）、4人（4%）；女性26人（72%）、8人（67%）、10人（83%）、8人（67%）
COVID-19疫苗接种次数，人数（百分比）：12次（6%）、2次（17%）、0次（0%）、0次（0%）；22次（61%）、9次（75%）、5次（42%）、8次（67%）；≥3次12次（33%）、1次（8%）、7次（58%）、4次（33%）
之前接种过的COVID-19疫苗种类（至少1剂），人数（百分比）：科兴疫苗14人（39%）、4人（33%）、7人（58%）、3人（25%）；阿斯利康疫苗20人（56%）、7人（58%）、6人（50%）、7人（58%）；辉瑞/生物技术公司疫苗15人（42%）、3人（25%）、8人（67%）、4人（33%）；莫德纳mRNA-1273疫苗5人（14%）、2人（17%）、0人（0%）、3人（25%）
上次接种COVID-19疫苗的时间，周数，中位数[四分位数范围]：87.5周[82, 107周]、85.5周[81.5, 105周]、90周[85, 110.25周]、85.5周[59, 96.25周]
之前接种流感疫苗的次数*，人数（百分比）：12次（33%）、1次（8%）、9次（75%）、2次（17%）
上次接种流感疫苗的时间，中位数[四分位数范围]，周数：33周[33, 33周]、112周[33, 33周]、45周[39, 51周]
加粗数值表示具有统计学显著性。*所有流感疫苗均为蛋源型且为标准剂量。
COVID-19指的是新冠病毒疾病；IQR表示四分位数范围。

免疫原性：主要的非劣效性分析是评估联合接种组与COVID-19疫苗组接种后免疫反应的几何平均比值情况（见图2）。对于针对SARS-CoV-2的干扰素-γ酶联免疫斑点反应，几何平均比值为1.03（95%置信区间：0.41-2.59）；而对于抗RBD抗体水平，该比值为0.82（95%置信区间：0.50-1.33）。由于两种指标的95%置信区间下限均低于预先设定的0.67这一非劣效标准，因此无法证明联合接种相比单独接种COVID-19疫苗具有非劣效性。对于SARS-CoV-2特定的干扰素-γ酶联免疫斑点反应和抗RBD抗体水平，我们在接种前后分别计算了几何平均值及其95%置信区间。这些几何平均值如图3所示，而几何平均值以及接种后与接种前的几何平均比值则汇总在表2中。

图2 接种后4周时，联合接种组与仅接种COVID-19疫苗组的免疫反应几何平均比值及其95%置信区间。ELISpot指的是酶联免疫吸附试验；RBD指的是受体结合域。

图3 展示了接种前后针对SARS-CoV-2的特异性免疫反应情况，以及它们的几何平均值和95%置信区间。（A）抗RBD IgG抗体水平。（B）干扰素-γ酶联免疫斑点反应结果。BAU表示结合抗体单位；ELISpot为酶联免疫吸附斑试验；PBMCs指外周血单核细胞；RBD为受体结合域；SFC为成斑细胞。表2 三组IFN-γ ELISpot检测结果与抗RBD抗体水平的几何均值及几何均值比值组别流感组（n=12）新冠组（n=12）联合接种组（n=12）IFN-γ ELISpot检测值，SFC/10^6 PBMCs?接种前几何均值及95%置信区间14.0（4.6-42.7）19.6（8.8-43.9）12.6（6.5-24.7）?接种后几何均值及95%置信区间15.2（4.5-51）59.9（26.2-136.9）*61.6（37.1-102.2）**?接种后与接种前的几何均值比及95%置信区间1.08（0.49-2.37）3.05（1.31-7.08）4.87（3.09-7.68）抗RBD抗体水平，BAU/mL?接种前几何均值及95%置信区间1074.2（574.3-2009.3）1276.3（933.9-1744.1）1299.7（729.7-2314.8）?接种后几何均值及95%置信区间1008.0（568.9-1786.2）10456.1（7688.6-14219.7）**8558.7（5666.6-12926.9）**?接种后与接种前的几何均值比及95%置信区间0.94（0.87-1.02）8.19（5.09-13.19）6.59（3.85-11.27）加粗数值表示具有统计学显著性。*与接种前相比，P=0.014。**与接种前相比，P<0.001。BAU表示结合抗体单位；ELISpot为酶联免疫吸附斑试验；PBMCs指外周血单核细胞；RBD为受体结合域；SFC为成斑细胞。流感组的IFN-γ ELISpot检测值的接种后与接种前几何均值比为1.08（95%置信区间：0.49-2.37），新冠组为3.05（95%置信区间：1.31-7.08），联合接种组为4.87（95%置信区间：3.09-7.68）。新冠组和联合接种组的检测值较基线有显著上升（P分别为0.014和P<0.001），而流感组则无显著变化。同样，抗RBD抗体水平的接种后与接种前几何均值比为流感组0.94（95%置信区间：0.87-1.02），新冠组8.19（95%置信区间：5.09-13.19），联合接种组6.59（95%置信区间：3.85-11.27）。新冠组和联合接种组的抗体水平均有显著上升（两者P均<0.001），流感组则无显著变化。联合接种组与仅接种新冠组在IFN-γ ELISpot检测值上的接种后与接种前几何均值比分别为1.60（95%置信区间：0.64-4.00；P=0.30），抗RBD抗体水平的该比值为0.80（95%置信区间：0.41-1.58；P=0.51）。不良事件在接种后30分钟内未观察到即时不良反应。7天内，流感组有83.3%的受试者出现不良事件，新冠组和联合接种组则各有100%的受试者出现不良事件（见表3）。大多数不良事件为局部反应，其中疼痛最为常见。与新冠组（75.0%）和联合接种组（83.3%）相比，流感组的全身性不良事件发生率显著较低（8.3%），差异具有统计学意义（P<0.05）。最常见的全身性不良事件是肌痛，但流感组未报告此类病例。所有不良事件均属轻度，且无需干预即可自行消退。表3 三组不良事件比较组别流感组（n=12）新冠组（n=12）联合接种组（n=12）总不良事件数及占比10（83.3）12（100.0）12（100.0）局部不良事件数及占比9（75.0）11（91.7）10（83.3）?疼痛9（75.0）10（83.3）10（83.3）?肿胀0（0.0）3（25.0）1（8.3）?发红0（0.0）2（16.7）1（8.3）?肿块0（0.0）3（25.0）0（0.0）全身性不良事件数及占比1（8.3）*9（75.0）10（83.3）?肌痛0（0.0）*7（58.3）9（75.0）?不适1（8.3）5（41.7）5（41.7）?头痛0（0.0）2（16.7）4（33.3）?发热0（0.0）1（8.3）2（16.7）?呼吸困难0（0.0）0（0.0）1（8.3）?恶心0（0.0）1（8.3）0（0.0）*与新冠组相比，P<0.05。COVID-19指冠状病毒病。讨论联合接种组与新冠组接种后的抗体几何均值比相当，为0.82（95%置信区间：0.50-1.33），不过该置信区间的下限仍低于预先设定的0.67这一非劣效性阈值。此外，联合接种组抗体反应的接种后与接种前几何均值比低于新冠组（分别为6.59和8.19），两组的该比值为0.80（95%置信区间：0.41-1.58；P=0.51）。这一趋势与早期研究结果一致，早期研究也发现同时接种新冠疫苗和流感疫苗时抗体反应会相应减弱。这些研究结果表明，联合接种可能会轻微影响针对SARS-CoV-2的体液免疫反应强度。目前对于抗体反应减弱的机制尚不明确，可能的机制包括：首先，免疫干扰机制可能起作用，但支持这一机制的证据较为有限，相关研究多集中在儿童疫苗联合接种领域。例如有一项针对儿童的研究发现，同时接种麻疹、腮腺炎、风疹疫苗和减毒活流感疫苗会显著降低对风疹病毒的抗体反应。其次，疫苗接种产生的I型干扰素可能会抑制抗体反应，但由于缺乏临床结局数据，这种抗体反应减弱的临床意义尚不清楚，需要进一步研究来验证这些机制是否能解释我们所观察到的现象。作为细胞介导的免疫反应替代指标的IFN-γ ELISpot检测值的接种后与接种前几何均值比在联合接种组与新冠组之间也相当，为1.03（95%置信区间：0.41-2.60），不过其置信区间下限仍低于0.67这一非劣效性阈值。与体液免疫反应相比，联合接种组IFN-γ ELISpot检测值的接种后与接种前几何均值比高于仅接种新冠组的对应比值（分别为4.87和3.05），两组的该比值为1.60（95%置信区间：0.64-4.00；P=0.30），这一趋势与抗体反应的情况相反。目前尚无研究报道过这种趋势，很可能是因为早期研究仅评估了体液免疫反应，未检测细胞介导的免疫反应。导致这一现象的潜在机制尚未明确，我们提出疫苗佐剂假说作为一种可能的解释。尽管当前研究结果显示流感疫苗不能引发针对SARS-CoV-2的免疫力，但灭活流感病毒在与新冠疫苗一同接种时，可能通过增强抗原呈递细胞的活性而起到类似佐剂的作用，不过VaxigripTetra疫苗本身并不含佐剂。不过这一假说仍较为薄弱且属于推测性质，需要进一步研究来验证这些初步观察结果。单独接种流感疫苗无法激发针对SARS-CoV-2的免疫反应，因为流感组IFN-γ ELISpot检测值和抗RBD抗体水平的接种后与接种前几何均值比分别为1.08（95%置信区间：0.49–2.37）和0.94（95%置信区间：0.87–1.02）。这些结果可能支持疫苗佐剂假说，但这一潜在的佐剂效应需谨慎解读，因为我们的研究并非专门为评估这一机制而设计。此前关于流感免疫力的研究显示，联合接种流感疫苗不仅能保持甚至还能增强针对流感病毒的特异性免疫反应。例如，在一组同时接种BNT162b2疫苗和重组四价流感疫苗的受试者中，与仅接种四价流感疫苗相比，他们对B/Victoria、B/Yamagata和A/H1N1毒株的免疫力有所提升。此外，一项关于同时接种灭活新冠疫苗和灭活四价流感疫苗的随机对照试验也显示，受试者对A/H1N1毒株的免疫力有所增强。这种免疫增强效果也可能源于新冠疫苗起到了佐剂作用，再加上流感病毒和SARS-CoV-2病毒存在共享的抗原区域。多项研究也证实了联合接种的安全性。与我们的研究结果相似，联合接种组与仅接种新冠组的不良事件发生率没有显著差异，说明同时接种的耐受性良好。本研究的一个优点在于，它是首项全面评估新冠疫苗和流感疫苗联合接种后细胞介导的免疫反应和体液免疫反应的研究。通过同时检测适应性免疫系统的这两种反应类型，我们的研究为了解联合接种策略的免疫学效应提供了更全面的视角。不过本研究也存在一些显著局限性。首先，由于样本量相对较小，统计功效较低，因此研究结论的可靠性有限。根据目前观察到的细胞介导的免疫反应和体液免疫反应的数据，分别只有16%和14%的统计功效能够证明两种反应不存在差异。如果未来想要达到80%的统计功效，那么在仅比较新冠疫苗组与联合接种组的情况下，分别需要约144名和163名受试者参与研究。其次，本研究仅检测了对武汉株SARS-CoV-2的免疫反应，但由于我们是进行相对比较，这些结果仍可反映整体的免疫反应情况。第三，我们对细胞介导的免疫反应的评估仅以IFN-γ作为替代指标，未检测其他相关指标如IFN-α。最后，我们没有使用流式细胞术来观察CD8+和CD4+ T细胞活性的详细表型特征。另一个局限性是，我们未评估流感病毒的特异性免疫原性。如前文所述，现有证据表明联合接种不会降低流感疫苗的免疫反应。考虑到这项初步研究的探索性质、资源限制，以及在此背景下评估SARS-CoV-2特异性细胞介导的免疫反应这一新颖性，我们将SARS-CoV-2的免疫反应作为主要研究重点。未来的更大规模研究应纳入流感病毒的免疫原性分析，以便更全面地了解联合接种的完整免疫学特征。此外，未来的研究还应探讨这些免疫学发现的临床意义，包括感染发生率及疾病严重程度，从而判断免疫反应的相似性是否真的能带来有效的保护作用。结论总体而言，各组接种后的免疫反应相当，不过其置信区间均低于统计学上的非劣效性阈值。就反应强度而言，与仅接种新冠疫苗相比，联合接种组的细胞介导的免疫反应增幅更大，而体液免疫反应增幅更小。各组的不良事件发生率也相当。这些研究结果可能支持联合接种策略的可行性，但还需要更大规模的进一步研究来确认免疫原性变化的趋势，并评估其临床意义。