《Current Biology》：Reconstruction of speciation by modification of major-effect genes in Petunia
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摘要翻译：种群内部和种群间的生殖隔离传统上被认为是通过许多微效表型效应的突变逐步进行的。与此观点相反，近期理论预测，当种群远离其表型最适值时，大效应突变变得可行。传粉者组合的变化严重损害了许多被子植物的生殖成功，创造了有利于大表型效应突变的条件。本研究探讨了主
摘要翻译：种群内部和种群间的生殖隔离传统上被认为是通过许多微效表型效应的突变逐步进行的。与此观点相反，近期理论预测，当种群远离其表型最适值时，大效应突变变得可行。传粉者组合的变化严重损害了许多被子植物的生殖成功，创造了有利于大表型效应突变的条件。本研究探讨了主效基因在矮牵牛属（Petunia）从天蛾传粉向蜂类传粉进化转变中的作用。研究人员通过在祖先的天蛾传粉的P. axillaris表型中修饰六个基因，创建了蜂类传粉的P. secreta花的模拟物，该模拟物在视觉外观和行为学测定中均与这种自然进化的物种无法区分。本研究独特地鉴定了解释两个物种之间转变的完整基因集，为大效应突变导致物种形成提供了罕见且令人信服的证据。
**论文解读：通过主效基因修饰重建矮牵牛属的物种形成**
**一、研究背景与科学问题**
物种形成的遗传基础是生物学中最基本的问题之一。达尔文将物种形成视为一个渐进过程，新性状在漫长时期内通过自然选择的累积作用逐渐演化，最终导致两个物种的分离。从遗传学角度看，这意味着许多微效突变缓慢地改变表型。然而，另一种观点认为物种形成是通过不同效应大小的突变进行的，其中一些突变对表型产生较大影响，而另一些则贡献较为微小。与先前的假设相反，该观点认为大效应突变不一定对物种形成过程有害，当种群远离其表型最适值时，大效应突变实际上可能是有益的。这一观点已通过越来越多在植物和动物中鉴定出的大效应物种形成基因而获得支持。
传粉者的转变在被子植物中频繁发生，并被广泛认为是其快速多样化和物种形成的驱动力。对传粉者转变的适应性响应涉及多个花部性状的变化，这些性状用于吸引可利用的传粉者并促进生殖成功。通过传粉者对植物的选择通常会导致适应最适值的重大转变，并且按照理论预测，涉及大效应基因。南美矮牵牛属（Petunia，茄科）是研究这一问题的理想模型。该属近期发生了多样化，物种形成屏障主要是由传粉者驱动的合子前隔离。矮牵牛属物种可明确分为两个支系：短管支系和长管支系。短管支系的所有物种均为蜂类传粉。相比之下，长管支系的物种表现出不同的传粉综合征，定义为与吸引特定传粉者相关的花部性状组合。该支系的共同祖先为天蛾传粉，但在进化过程中，发生了多次独立的向蜂类或蜂鸟传粉的转变。
P. axillaris和P. secreta均为长管支系物种，在巴西南部可近距离分布，但两者之间的杂种罕见，表明存在几乎完全的生殖隔离。这两个物种形态相似，但在花色和花香上存在差异。P. axillaris保留了关键的祖先性状，包括白色花色、UV吸收以及释放大量花香挥发物，以吸引夜行性天蛾。相比之下，P. secreta已进化为吸引蜂类，表现为品红色花朵、UV反射且释放极少量的花香挥发物。本研究基于对矮牵牛属主要花部性状差异的遗传学理解，成功重建了从P. axillaris到P. secreta的进化转变，探究了每个性状如何影响传粉者偏好，揭示了传粉综合征转变背后的遗传机制。
**二、主要技术方法**
研究人员综合利用了多种前沿技术手段。首先，对P. axillaris和P. secreta进行了基于PacBio Sequel II平台的基因组测序与从头组装，并利用MAKER2流程进行结构注释。其次，采用RNA测序（RNA-seq）和等位基因特异性表达（ASE）分析比较了P. axillaris、P. secreta及其F1杂种中候选基因的表达差异。第三，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术靶向Odo1基因。第四，通过农杆菌介导的稳定遗传转化构建了花青素生物合成基因的过表达株系。最后，以P. axillaris的自然传粉者烟草天蛾（Manduca sexta）和常见蜂类模型物种欧洲熊蜂（Bombus terrestris）为对象，在飞行笼和风洞中开展了成对传粉者选择行为学测定。植物材料来源包括：P. axillaris来自德国罗斯托克植物园和伯尔尼大学植物园，P. secreta采集自巴西Rio Grande do Sul的Galp?o de Pedra自然栖息地。
**三、研究结果**
**1. 消除P. axillaris的花香**
花香散发的丧失是与矮牵牛属从天蛾传粉向蜂类传粉转变相关的三个主要花部性状之一。RNA-seq分析显示，P. secreta中ODO1转录水平显著低于P.axillaris（降低10.6倍）。ASE分析显示P. axillaris转录本显著富集（主要等位基因频率：0.79，p<0.001），表明P. secreta至少部分由于ODO1的顺式调控突变而丧失花香产生能力。启动子序列分析鉴定出P. secreta的ODO1启动子存在缺失，该缺失移除了一个在芳香物种中保守的功能性MYB结合位点（MYBBS1）。利用CRISPR-Cas9产生的两个独立移码突变等位基因能够显著降低苯甲酸甲酯和苯甲醛的释放，且不影响可见光和UV颜色。行为学实验表明，天蛾M. sexta明显偏好野生型P. axillaris而非无香突变体，而B. terrestris对两者无偏好，表明天蛾比蜂类更依赖花香进行花卉选择。
**2. 在P. axillaris中恢复完整的可见花色**
花色差异涉及至少两个主效基因：AN2和MYB-FL，它们分别编码控制可见光谱（花青素）和UV光谱（黄酮醇）色素产生的R2R3-MYB转录因子。在P. axillaris中，AN2因单核苷酸缺失而丧失功能，而MYB-FL功能正常。向P. axillaris转入功能性AN2基因（由查尔酮合酶启动子pCHS驱动）后，花朵呈现淡粉色，但颜色强度不足。将myb-fl突变与pCHS::AN2转基因结合后，花色强度仍未能达到P. secreta的水平。研究人员推测这可能是因为花青素生物合成途径中的结构基因在P. axillaris进化过程中因放松选择而退化。在pCHS::AN2/myb-fl背景中进一步转入由35S启动子驱动的功能性HF1、MT和MF2基因后，花朵表现出深品红色，在可见光和UV光下均与P. secreta相似。
**3. 通过产生P. secreta模拟花追踪进化**
将无香的odo1-1等位基因导入深色花的myb-fl/pCHS::AN2/p35S::HF1/p35S::MT/p35S::MF2品系中，成功创建了一个在可见光和UV光下外观以及花香释放方面均与P. secreta高度相似的“模拟株”。关键实验表明，熊蜂B. terrestris在P. secreta与模拟株之间的直接比较中无偏好，证明传粉者无法区分两者。因此，仅改变六个基因即可重建从天蛾传粉到蜂类传粉的传粉综合征转变。
**4. 解析花部性状对传粉者行为的贡献**
为探究各花部性状的独立和组合效应，研究人员对部分模拟株系进行了成对传粉者选择实验。天蛾对野生型P. axillaris表现出强烈偏好，而任何单一主效基因突变（ODO1、MYB-FL或AN2）都足以显著降低天蛾的吸引力。蜂类对花香变化中性，但MYB-FL或AN2的遗传修饰能促进蜂类吸引。蜂类对部分模拟株系的偏好高于P. axillaris，但只有同时修饰MYB-FL和AN2时，蜂类才不再对P. secreta表现出强烈偏好。值得注意的是，恢复完整可见花色并非吸引蜂类的必要条件，淡粉色花朵也能有效吸引蜂类。
**四、讨论与结论**
本研究鉴定了解释两个物种之间转变的完整基因集——三个转录因子（AN2、MYB-FL和ODO1）和三个花青素生物合成基因（HF1、MT和MF2）。其中三个花青素生物合成基因很可能在共同祖先中具有功能，在P. axillaris谱系中退化。因此，三个转录因子基因的突变可能足以通过分别改变可见花色、UV花色和花香来实现矮牵牛属长管支系中从天蛾传粉向蜂类传粉的进化。通过分析部分模拟株系，研究人员测试了这些主效基因对传粉者偏好的独立或组合贡献。花香是天蛾吸引的重要线索，而蜂类对花香的响应中性，表明AN2和MYB-FL的变异是适应蜂类传粉的驱动因素。MYB-FL的缺失能将代谢流从黄酮醇转向花青素生物合成，似乎是这一传粉者转变的初始靶标。AN2和MYB-FL及ODO1均为R2R3-MYB转录因子家族成员，其限制性的时空表达模式和功能特异性最小化了有害的多效性效应，使得有效选择成为可能。总之，本研究鉴定了解释两个物种之间转变的完整基因集，为大效应突变导致物种形成提供了罕见且令人信服的证据。
