BMDMSCs中Decorin与IL-10的共表达可减轻肺纤维化——一项实验研究

《International Journal of Surgery》：Decorin and IL-10 co-overexpression in BMDMSCs attenuates pulmonary fibrosis – an experimental study

　　背景：本研究旨在探讨在人类骨髓来源的间充质干细胞中同时过表达decorin和IL-10[HBMDMSCsDO (DEC/IL-10)]是否能保护小鼠免受博来霉素诱导的肺纤维化影响。方法：L2细胞和NR8383细胞被给予不同浓度的博来霉素处理（0–2.5 μg/mL）。在体内实验中，动物被分为四组：第1组为假手术对照组；第2组为单纯肺纤维化组；第3组为肺纤维化加HBMDMSCs治疗组；第4组为肺纤维化加HBMDMSCsDO (DEC/IL-10)治疗组。结果：博来霉素在其半数有效浓度下会显著降低L2细胞和NR8383细胞的存活率，同时增加早期和晚期细胞凋亡以及TGF-β的表达水平（P< 0.001）。博来霉素处理还会在L2细胞中引发氧化应激、细胞应激信号传导以及上皮-间充质转化相关标志物的升高，而这些效应可通过decorin、HBMDMSCs、过表达decorin的HBMDMSCs或抑制p22phox活性得到逆转（P< 0.001）。在L2细胞和CG1629细胞中，沉默decorin会加剧上皮-间充质转化及细胞应激相关标志物的表达，而这些效应可通过decorin处理、decorin过表达或MSCDO (DEC/IL-10)得到缓解（P< 0.001）。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠中，第1组的血氧饱和度最高，第2组最低，而第4组的血氧饱和度则高于第3组；与此同时，肺部损伤、纤维化程度、右心室压力以及炎症细胞的数量则呈现相反的变化趋势（P< 0.0001）。肺部中与上皮-间充质转化/增殖相关的蛋白、氧化应激相关蛋白以及纤维化相关蛋白的表达水平与肺部损伤程度呈正相关（P< 0.0001）。结论：HBMDMSCsDO (DEC/IL-10)治疗能有效保护啮齿类动物的肺部免受博来霉素诱导的肺纤维化损害。要点：在人类骨髓来源的间充质干细胞中同时过表达decorin和IL-10可显著减轻博来霉素诱导的上皮-间充质转化、氧化应激及肺纤维化现象。p22phox作为连接氧化应激、炎症反应与上皮-间充质转化的关键分子，在肺组织纤维化进程中起推动作用。过表达decorin/IL-10的HBMSCs在改善氧合状况、降低右心室压力以及减轻肺纤维化损伤方面表现优于未经处理的HBMSCs。该疗法可通过同时调控Wnt/β-catenin、MAPK、氧化应激以及TGF-β/Smad3信号通路，从多个分子层面阻止纤维化的进展。引言：尽管特发性肺纤维化的发病机制尚未完全明了，但数十年的研究已确定其为一种典型的慢性、进行性肺实质纤维化疾病[1–6]。遗憾的是，即便采用积极的治疗手段，晚期特发性肺纤维化患者的长期预后依然不佳[7,8]，这凸显出对有效治疗方案的迫切需求。虽然肺移植或心肺联合移植[9]仍是最后的选择，但由于供体器官的匮乏，其应用受到限制，这就更加需要安全有效的替代治疗方案。值得欣慰的是，随着对特发性肺纤维化独特组织病理学特征的深入研究，我们越来越清楚异常的上皮细胞如何通过多种信号机制与间充质细胞、免疫细胞及内皮细胞相互交流，进而引发成纤维细胞和肌成纤维细胞的活化[1–6]。这些研究结果表明，转化生长因子β（TGF-β）[1,10–15]以及上皮-间充质转化过程[16,17]在肺纤维化的发生和发展中起着核心作用。在正常情况下，肺部具有自我修复和重建受损肺实质的能力，但在特发性肺纤维化状态下，这种伤口愈合机制会受到严重破坏，从而导致上皮细胞与间充质细胞之间的相互作用出现异常[11,14]。此外，受损的愈合过程还会引发成纤维细胞活化，进而激活发育相关信号通路，产生一系列促炎细胞因子和分子，这些物质会促进成纤维细胞增殖并导致细胞外基质过度积累[11,14,18]。基础研究已经明确，TGF-β是一种具有多种功能的双链细胞因子，它能调控细胞的增殖、分化以及上皮-间充质转化过程[14,19,20]。在伤口愈合过程中，由肺泡上皮细胞、浸润的炎症细胞/巨噬细胞、血小板颗粒以及免疫细胞产生的TGF-β，可通过促进细胞外基质的生成与沉积、吸引炎症细胞以及推动成纤维细胞分化来助力伤口愈合[14,19]，这说明TGF-β对所有类型组织纤维化的发生与发展都至关重要[14,21]。值得注意的是，细胞外基质的过度生成会导致物质过度沉积、瘢痕形成以及组织纤维化，而这些现象在特发性肺纤维化中普遍存在[14,20]。当组织受损时，一系列复杂的信号事件会被激活，从而启动适应性免疫系统，引发炎症反应，进一步促进上皮-间充质转化的发生[16,22,23]。上皮-间充质转化是一种生物学过程，在此过程中，上皮细胞会失去细胞间黏附力及顶端-基底极性，经历显著的细胞骨架重构，并获得间充质细胞的特性，如更强的迁移能力、侵袭能力以及更强的细胞外基质生成能力[17,24,25]。这一过程受到多种细胞外配体的严格调控，包括TGF-β、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子、白细胞介素-1（IL-1）、核因子-κB（NF-κB）以及Wnt信号通路[17,24,25]。在纤维化过程中，持续存在的诱导上皮-间充质转化的信号会推动细胞外基质的积累，进而导致组织结构重塑[17,26]。尤其重要的是，已有研究表明上皮-间充质转化在间质纤维化的发生和发展中起着关键作用，它能够介导肺泡上皮细胞向下方成纤维细胞的信号传递[27]。这种上皮细胞与间充质细胞之间的信号交互作用是由ZEB1蛋白调控的，而在细胞外基质沉积部位附近的肺泡II型细胞中，ZEB1的表达量会升高。事实上，肺纤维化长期以来就被视为一种II型上皮-间充质转化事件[28,29]。Decorin是一种平均分子量为90–140 kDa的蛋白聚糖[30,31]，它是一种具有复杂调控功能的分子[32,33]。Decorin主要由成纤维细胞合成，它在多种生理和病理过程中发挥着重要作用，包括调控成骨干细胞的功能、肌肉发育、伤口愈合、心肌梗死、肾小管间质纤维化以及癌症的进展过程[34–37]。有研究显示，decorin缺乏会促进结直肠癌中的上皮-间充质转化和癌细胞转移[38]；相反，decorin处理可以有效抑制上皮-间充质转化、胶原蛋白生成、纤维形成、纤连蛋白表达、补体C1活性以及EGF受体信号传导[39–42]。IL-10是一种重要的抗炎和抗纤维化细胞因子，在实验性肺纤维化模型中具有明确的保护作用[43,44]。先前的研究已经证明，IL-10可通过减少促炎细胞因子的生成、限制巨噬细胞的活化、减轻氧化应激以及抑制TGF-β/Smad2/3信号通路，有效缓解博来霉素诱导的肺部炎症反应[45–47]。通过这些作用，IL-10能够抑制肌成纤维细胞的分化以及胶原蛋白的沉积，从而延缓纤维化的进展。此外，许多研究还表明，间充质干细胞具有强大的抗炎作用，能够调节免疫功能并促进组织再生[48–50]，同时还能在缺血和毒性环境中维持细胞和器官的存活[51,52]。多项动物模型研究也证实，间充质干细胞治疗能够有效保护器官功能，避免缺血-再灌注损伤或缺血诱发的其他损伤[53]。肺纤维化的形成是炎症、氧化损伤、上皮-间充质转化以及TGF-β驱动的成纤维细胞活化等多种过程共同失调的结果。因此，仅针对某一单一通路进行治疗很难实现全面的治疗效果。为了解决这一问题，我们试图通过在人类骨髓来源的间充质干细胞中同时表达decorin和IL-10，来实现多途径的协同抑制作用。IL-10主要负责抑制上游的炎症和免疫反应，而decorin则主要抑制下游的TGF-β信号通路、细胞外基质重塑以及上皮-间充质转化过程。基于这两种互补的作用机制，我们对HBMDMSCs进行了基因工程改造，使其同时过表达decorin和IL-10（以下简称HBMDMSCs DO (DEC/IL-10)），以此提升其在缓解博来霉素诱导的鼠类肺纤维化方面的治疗效果。本研究报告遵循TITAN指南[54]撰写，且未使用任何人工智能工具辅助完成。材料与方法伦理声明：所有动物实验均获得了本机构动物护理与使用委员会的批准，并严格按照《实验室动物护理和使用指南》进行。本研究也遵循ARRIVE指南（《科研中的动物：体内实验的报告规范》）的要求进行报告[55]。所有动物都被饲养在我们医院内经过美国实验室动物护理与评估认证协会（AAALAC；位于美国马里兰州弗雷德里克市）认证的设施中，饲养环境中的温度控制在24℃，光照周期为12小时亮期/12小时暗期。细胞系培养方案：在本研究中，大鼠肺上皮L2细胞（BCRC 60276；传代次数为3–6代）被培养在含有10%胎牛血清的Ham’s F-12培养基（Gibco，编号11765054）中；正常人源成纤维细胞（CG1629；编号08C0011）则被培养在含有15%胎牛血清的DMEM培养基中。所有培养基中还额外添加了100 μg/mL的链霉素和100 U/mL的青霉素。细胞培养均在含5%二氧化碳的湿润环境、37℃的温度条件下进行。HBMDMSCs的来源及其培养方法：HBMDMSCs细胞系是从Lonza Bioscience公司获得的。进行细胞培养时，使用的是表面涂有明胶的培养皿，培养基为添加了hMSC SF1因子的hMSC SF1基础培养基，该培养基还进一步加入了20%胎牛血清、100 μg/mL的链霉素以及100 U/mL的青霉素。细胞培养均在含5%二氧化碳的湿润培养箱中、37℃的温度下进行。L2细胞、CG1629细胞以及HBMDMSCs的decorin基因过表达载体转染：L2细胞的转染操作、CG1629细胞的转染操作、HBMDMSCs的转染操作均参照了我们之前的研究方法[56,57]。简而言之，pcDNA3.1(+)-DEC载体是从台湾新北市的Genomics, Inc.公司购买的。载体转染过程是按照说明书中的步骤，使用Lipofectamine 3000试剂进行的。具体操作步骤如下：首先将15 μg的decorin表达载体与30 μL的Lipofectamine 3000试剂在室温下混合孵育15分钟，之后将其置于含5%二氧化碳的湿润环境、37℃下过夜孵育，之后再进行后续实验。HBMDMSCs的decorin基因和IL-10基因载体转染[DO (DEC/IL-10)]：pcDNA3.1 myc/his IL-10载体是我们实验室自行构建的，而pcDNA3.1 (+) DCN载体则是从台湾新北市的Genomics Inc.公司购买的。HBMDMSCs的转染操作同样参照了我们之前的研究方法[56,57]。简而言之，转染操作也是按照制造商的说明，使用Invitrogen公司的Lipofectamine 3000试剂进行的，具体操作为将15 μg的载体与30 μL的Lipofectamine 3000试剂混合，然后在室温下孵育15分钟，之后加入细胞中。细胞随后在含5%二氧化碳的湿润环境、37℃下过夜孵育，之后再使用这些经过转染的细胞开展后续实验。经过转染后，不同细胞类型的转染效率大约在40%到60%之间，而过表达或基因沉默实验中的蛋白质表达水平差异可达两倍以上。L2细胞的CYBA（p22phox）基因过表达载体转染：L2细胞的CYBA基因过表达载体转染操作也是参照了我们之前的研究方法[56,57]。简而言之，pcDNA3.1/hygro CYBA载体是由台湾新北市的OMICS Biotechnology Co., Ltd.公司生产的。载体转染过程同样是按照说明书中的步骤，使用Lipofectamine 3000试剂进行的。具体操作步骤如下：首先将15 μg的CYBA表达载体与30 μL的Lipofectamine 3000试剂在室温下混合孵育15分钟，之后将其置于含5%二氧化碳的湿润环境、37℃下过夜孵育，之后再进行后续实验。肺纤维化模型的建立方法：本研究使用了体重为22–25克的无病原体感染的雄性C57BL/6（B6）小鼠（来自Charles River Technology公司以及台湾BioLASCO Co., Ltd.公司）。博来霉素的给药方法参照了之前的研究方案[58]并做了少量修改。简而言之，每组小鼠都会先被2.0%的异氟烷麻醉，然后被放置在温度为37℃的保温垫上。麻醉完成后，这些小鼠会被进行气管插管，然后通过小型动物呼吸机（SAR-830/A，来自美国CWE Inc.公司）以180 mL/min的流量用空气进行通气。为了诱导肺纤维化，我们将MP Biomedicals公司生产的博来霉素硫酸盐溶解在0.9%的生理盐水中，然后将其装入IA-1C型液体微喷装置（来自美国宾夕法尼亚州Wyndmoor市的Penn-Century公司）中。在博来霉素给药后的第1天，我们将上述溶液以30 μL的体积，通过气管喷雾的方式给予已经接受过轻度异氟烷麻醉（2.0%的异氟烷溶于100%的氧气中）的小鼠，给药总剂量为4 mg/kg。这个剂量是根据之前的研究结果[58]稍作调整后确定的。对照组小鼠则通过相同途径接受50 μL的0.9%生理盐水注射。随机分组与盲法处理：所有动物都是通过计算机生成的随机序列被随机分配到不同的实验组中。每只动物都有一个唯一的识别编号，而各组的分配信息则被保存在依次编号的密封不透明信封中，这些信封直到实验干预开始时才会被打开。在数据收集和分析的全过程中，所有负责评估实验结果的人员——包括那些负责检测生理指标、血流动力学数据、进行组织学检查以及分子分析的研究人员——都对各组的分配情况一无所知。治疗代码也会在所有数据都被记录、核实并且完成初步统计分析之前一直保密。共有40只小鼠被平均分配到四组中：第1组为假手术对照组，仅接受50 μL的0.9%生理盐水气管喷雾处理；第2组为单纯肺纤维化组；第3组为肺纤维化组，即在博来霉素给药后的第7天、第10天、第15天、第20天以及第25天通过静脉注射6.0 × 105个HBMDMSCs细胞；第4组也为肺纤维化组，但其治疗方案为在博来霉素给药后的相同时间点通过静脉注射6.0 × 105个HBMDMSCsDO (DEC/IL-10)细胞。我们选择的每组动物数量为8–10只，这一数值是根据我们之前关于博来霉素诱导的肺纤维化以及间充质干细胞干预研究的经验确定的[59]，因为在该类研究中，相似的样本量就已经足以在可接受的变异范围内检测出治疗效应。我们最近的一项研究[60]表明，反复输注脂肪来源的间充质干细胞能够增强恩格列净在大鼠糖尿病肾病模型中的肾脏保护作用。因此，本研究中采用的细胞疗法的剂量及给药方案是基于我们之前的研究结果[60]确定的。右侧与左侧血流动力学评估其操作流程和方案已在我们的先前报告中有描述[61]。简言之，在给予BLM处理后的第35天，用2.0%的异氟烷对小鼠进行麻醉，使其仰卧在设定为37℃的保温垫上，进而进行正中线剖腹手术。剃除胸部毛发后，每组小鼠均通过气管插管，并使用小型动物呼吸机（SAR-830/A，CWE Inc., 美国）以室温下的空气以180 mL/min的速度进行机械通气。通过左侧开胸术暴露心脏。将一根无菌的20号、带软塑料涂层的针头插入每只动物的右心室和左心室，用以测量右心室收缩压——这一数值可间接反映肺动脉收缩压——以及左心室收缩压，后者可间接反映全身动脉压力。压力信号会被传输至压力传感器（UFI，Model 1050，加利福尼亚州，美国），随后经过桥式放大器（ML866 PowerLab 4/30数据采集系统，ADInstruments Pty Ltd.，新南威尔士州卡斯尔山，澳大利亚）进行放大和数字化处理。数据则通过LabChart软件（ADInstruments）进行记录和分析。完成血流动力学检测后，对这些小鼠实施安乐死，并取出肺部以作进一步分析。同时测量每只动物的肺重量。左肺被固定在4%的甲醛中，然后嵌入石蜡中用于组织学检查；而右肺则被切块，置于液氮中冷冻，保存在-80℃下，以供后续的分子生物学研究使用。肺损伤的组织学评估及肺实质的拥挤程度评分为了验证肺实质中肺泡囊的异常情况，所有动物的左肺标本在嵌入石蜡之前先被固定在10%的缓冲甲醛中，之后将组织切成5微米厚的切片，以便进行光学显微镜分析。按照我们之前的研究方法[61]，采用盲法通过H&E染色来确定肺泡囊的数量。每只小鼠的三个肺切片都会被分析，每个切片中随机选取三个高倍视野（200×）进行观察。随后通过将所有数值相加后再除以9，得出每只动物每个高倍视野的平均数值。此外，还以盲法测定肺实质中拥挤区域的范围——该区域指的是在H&E染色的切片上，因肺泡部分或完全塌陷而出现的肺间隔增厚区域。所采用的评分标准如下：0=未检测到拥挤区域；1=拥挤区域占比<15%；2=16–25%；3=26–50%；4=51–75%；5=76–100%（针对每个200×的高倍视野）。组织学评分由具备资质的技术人员在不知晓分组情况的前提下独立完成。西方印迹分析西方印迹分析的方法与我们之前描述的一致[56,57,61]。具体而言，等量的蛋白质提取物（50微克）被加载到SDS-PAGE凝胶中并分离。分离后的蛋白质被转移到PVDF膜上，随后在含5%脱脂干牛奶的T-TBS缓冲液（TBS中含0.05%的Tween 20）中浸泡过夜，以此封闭非特异性结合位点。之后，这些膜与多种一抗共同孵育，这些一抗包括针对周期蛋白D（1:3000，Abcam）、周期蛋白E（1:3000，Abcam）、层粘连蛋白（1:3000，Novus Bio）、E-钙粘蛋白（1:3000，Abcam）、E-Smad3（1:3000，Abcam）、Twist（1:3000，Abcam）、Snail（1:1000，Cell Signaling Technology）、TGF-β（1:3000，Abcam）、β-连环蛋白（1:1000，Cell Signaling Technology）、波形蛋白（1:1000，Cell Signaling Technology）、α-SMA（1:4000，Sigma）、p-Smad3（1:1000，Cell Signaling Technology）、p-Smad2（1:1000，Cell Signaling Technology）、p-ERK1/2（1:3000，Merck）、p-JNK（1:3000，Abcam）、p-p38（1:4000，Sigma）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）（1:3000，Affbiotech）、胶原蛋白1（1:4000，Sigma）、弹性蛋白（1:3000，Affbiotech）、c-Myc（1:3000，Abcam）、超氧化物歧化酶（SOD）（1:3000，Affbiotech）、Twist（1:3000，Abcam）、TGF-β II受体（1:3000，Abcam）、NOX1（1:3000，Sigma）、NOX2（1:4000，Sigma）、NOX4（1:3000，Abcam）、NF-κB（1:3000，Cell Signaling）、p22phox（1:3000，Abcam）、Zeb1（1:1000，Cell Signaling）、Wnt1（1:3000，Novus Bio）、Smad3（1:1000，Cell Signaling）、Smad2（1:1000，Cell Signaling）以及β-Actin（1:10,000，Merck），孵育时间为1小时，温度为室温。随后使用辣根过氧化物酶偶联的抗兔免疫球蛋白IgG（1:2000；Cell Signaling）作为二抗，在室温下再孵育1小时。在1小时内需重复进行八次洗涤操作。免疫反应带通过增强型化学发光技术（ECL；Amersham Biosciences）被可视化，之后再用Biomax L胶片（Kodak）进行曝光。为了进行量化分析，这些ECL信号会通过Labwork软件（UVP）被数字化处理。免疫荧光染色其操作流程和方案也在我们之前的报告中有详细描述[56,57,61]。重新水化的石蜡切片先在3%的H2O2中处理30分钟，然后在室温下与Immuno-Block试剂（BioSB，加利福尼亚州圣巴巴拉，美国）孵育30分钟。之后，这些切片会与针对γ-H2AX的一抗（1:200；Abcam）共同孵育。每只小鼠的三个肺切片都会被分析。为了进行量化，每个切片中会随机选取三个高倍视野——对于免疫组化及免疫荧光研究而言，放大倍数为200倍——进行检测。随后通过将所有阳性染色细胞的数值相加后再除以9，得出每只动物每个高倍视野的平均阳性细胞数。肺纤维化的组织学量化分析其相关流程和方案同样在我们之前的报告中有说明[61]。具体来说，采用了Masson三色染色法来识别肺部的纤维化区域。每只动物会用冷冻切片机（Leica CM3050S）制作出厚度为4微米的连续三个肺切片。随后使用Image Tool 3（IT3）图像分析软件（德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心，UTHSCSA；Windows版Image Tool，3.0版本，美国）来计算每个切片上纤维化区域的积分面积（单位为微平方米）。每个切片中会随机选取三个100倍放大的高倍视野进行分析。在确定每个高倍视野中每个纤维化区域的像素数之后，会将三个高倍视野的像素数加总。每只动物的另外两个切片也会重复这一流程。最终通过将所有像素数相加后再除以9，得出每只动物每个高倍视野的平均像素数。而每个高倍视野下肺实质纤维化区域的平均积分面积，则是通过19.24这个转换因子计算得出的——1微平方米对应19.24个像素。凋亡以及细胞内/线粒体活性氧水平的流式细胞术分析，还包括相应的门控策略方法学通过流式细胞术（Beckman Coulter Life Sciences）结合annexin V和碘化丙啶（PI）的双重染色，来测定存活细胞与凋亡细胞的百分比。早期凋亡表现为annexin V+/PI?的状态，而晚期凋亡则为annexin V+/PI+的状态。针对细胞内和线粒体内的活性氧水平，分别通过H2DCFDA和MitoSOX两种染料来进行流式细胞术分析，以此检测总的细胞内活性氧水平以及线粒体内的活性氧水平。外周血单核细胞（1.0×10^6个细胞）会同时被FITC标记的抗CD3抗体（BD Bioscience）、PE标记的抗CD8抗体（BD Bioscience）、BB700标记的抗CD4抗体（BD Bioscience）、FITC标记的抗CD25抗体（BD Bioscience）以及PE标记的抗CD127抗体（BD Bioscience）进行三重染色。随后使用Gallios流式细胞仪（Beckman Coulter）来分析CD3+ CD4+辅助性T细胞、CD3+ CD8+细胞毒性T细胞以及CD4+ CD25+ CD127(low/?)调节性T细胞的数量。为了识别人类外周血单核细胞中的L2细胞（即活性氧表达细胞）、炎症细胞以及免疫细胞，我们在分析表面标志物之前，采用了顺序门控策略，先将碎片、双细胞以及死亡细胞排除在外。统计分析定量数据以均值±标准差的形式呈现。在开展统计检验之前，首先会使用Shapiro–Wilk检验来判断每组数据的正态分布情况，同时使用Levene’s检验来评估各组间方差的均匀性。对于同时满足正态性和方差齐性假设的数据，会采用单因素方差分析来比较不同组间的差异。如果整体方差分析结果显示各组之间存在显著差异，那么就会采用Bonferroni校正法来进行后续的成对比较，以此控制多重检验带来的误差。如果方差分析的假设不成立，则会采用非参数统计方法——即先进行Kruskal–Wallis检验，然后再进行经过Bonferroni校正的Dunn事后检验。所有的统计分析都是使用SAS软件的Windows版本8.2（SAS Institute，北卡罗来纳州凯里市，美国）来完成的。P值小于0.05时，即认为该结果具有统计学显著性。研究结果关于在初步研究中使用肺泡巨噬细胞的理由为了验证我们的假设，我们使用了NR8383细胞——一种已广泛研究的正常大鼠肺泡巨噬细胞系——开展了体外初步研究。肺泡巨噬细胞是肺部免疫系统的重要组成部分，在肺纤维化的发生与发展过程中起着核心作用。尤其是由单核细胞衍生的肺泡巨噬细胞，已被证实可以通过激活成纤维细胞来推动疾病进展，而这些成纤维细胞又会进一步促进过多的胶原沉积以及纤维化瘢痕的形成[62]。鉴于肺泡巨噬细胞在纤维化形成过程中的关键作用，NR8383细胞作为一种相关且易于获取的模型，非常适合用来研究这一过程中巨噬细胞所发挥的机制。这些探索性实验的结果可见于补充数字内容中的图表，链接地址为：https://links.lww.com/JS9/H555。逐步增加BLM浓度对L2细胞活力以及培养72小时后凋亡率和TGF-β蛋白表达的影响为了评估BLM对肺上皮细胞的细胞毒性，我们将L2细胞——一种具有典型上皮形态的大鼠来源肺上皮细胞系——暴露在逐渐升高的BLM浓度环境中（浓度分别为0、0.5、1.5和2.5微克/毫升）。实验结果表明，在BLM处理后的24、48和72小时，细胞的活力均出现显著下降，且这种下降呈剂量依赖性。与之相反的是，到了72小时时，早期和晚期的凋亡率以及TGF-β蛋白的表达水平则均出现显著且逐步上升的趋势。这些发现表明，细胞的增殖能力与BLM的浓度呈负相关，而细胞死亡则与BLM剂量的增加呈正相关（见图1以及补充数字内容中的图1，链接地址为https://links.Lww.Com/JS9/H555）。基于这些结果，我们选择1.5微克/毫升的BLM浓度作为后续体外实验的适宜剂量。开放多媒体模式图1.开放多媒体模式逐步增加博莱霉素浓度对培养24、48和72小时时细胞活力以及凋亡率和TGF-β蛋白表达的影响。(A) 24小时时的细胞活力：*与其他组相比，不同符号代表不同差异水平（?、?、§），P<0.0001。(B) 48小时时的细胞活力：*与其他组相比，不同符号代表不同差异水平（?、?、§），P<0.0001。(C) 72小时时的细胞活力：*与其他组相比，不同符号代表不同差异水平（?、?、§），P<0.0001。(D1–D4) 流式细胞术分析结果，展示了培养72小时时早期和晚期凋亡细胞的识别情况。(D5) 早期凋亡细胞（AN-V+/PI-）的数量分析结果：*与其他组相比，不同符号代表不同差异水平（?、?、§），P<0.0001。(D6) 晚期凋亡细胞（AN-V+/PI+）的数量分析结果：*与其他组相比，不同符号代表不同差异水平（?、?、§），P<0.0001。(E) 转化生长因子TGF-β的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号代表不同差异水平（?、?、§），P<0.0001。所有的统计分析均采用单因素方差分析，之后再进行Bonferroni多重比较事后检验（每组样本量为4）。符号（*、?、?、§）表示各组之间的显著性差异，显著性水平为0.05。HBMDMSCsOve-DEC能有效保护L2细胞免受博莱霉素诱导的细胞增殖抑制，同时降低活性氧水平及细胞内钙离子浓度为阐明在BLM处理条件下，过表达装饰素的水平对HBMDMSCs（即HBMDMSCsOve-DEC）在维持细胞增殖以及减轻细胞内和线粒体活性氧水平方面的作用，我们将L2细胞分为五组：A1组仅包含L2细胞，A2组包含L2细胞加上1.5微克/毫升浓度的BLM，A3组则在A2组的基础上再加入100纳摩尔浓度的装饰素，A4组是在A2组基础上加入HBMDMSCs，而A5组则是同时在A2组的基础上加入HBMDMSCsOve-DEC。实验结果显示，在24、48和72小时时，A1组的细胞活力均为最高，而且从A2组到A5组，细胞活力呈逐步上升的趋势（见图2以及补充数字内容中的图2，链接地址为https://links.Lww.Com/JS9/H555）。相比之下，流式细胞术分析显示，在72小时时，A1组的细胞内和线粒体内的总活性氧水平，以及早期和晚期的凋亡率均为最低，而且这些数值从A2组到A5组均出现显著下降。免疫荧光显微镜分析进一步表明，作为反映与活性氧水平相关的细胞内钙离子浓度的指标，Fluo-4 AM的平均荧光强度在A1组中最低，而在A2组中最高。值得注意的是，A5组的这一荧光强度明显低于A3组和A4组，而A3组与A4组之间的荧光强度则没有显著差异。同样，比色分析也显示，作为脂质过氧化和氧化应激标志物的丙二醛水平在不同组间的变化趋势与Fluo-4 AM类似。总体而言，这些研究结果表明，BLM处理会引发严重的细胞损伤，其表现形式包括细胞内和线粒体活性氧水平的升高、脂质过氧化以及细胞内钙离子浓度的上升。而装饰素处理或HBMDMSCs处理都能显著减轻这些有害影响，其中HBMDMSCsOve-DEC的处理效果更为优异。图2. 多媒体展示。在HBMDMSCs中过表达decorin基因可有效保护L2细胞免受博来霉素诱导的细胞增殖抑制，同时降低ROS生成及细胞内Ca2+水平。(A) 24小时时的细胞存活率：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §, ?)，P<0.0001。(B) 48小时时的细胞存活率：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §, ?)，P<0.0001。(C) 72小时时的细胞存活率：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §, ?)，P<0.0001。(D1–D12) 流式细胞术分析，用于检测细胞内及线粒体内的活性氧物种。(D6) 细胞内总活性氧的平均荧光强度（即H2DCFDA）：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §, ?)，P<0.0001。(D12) 线粒体活性氧的平均荧光强度（即DHR123）：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §, ?)，P<0.0001。(E1–E5) 流式细胞术分析，用于检测培养72小时后细胞的早期与晚期凋亡情况。(E6) 早期凋亡细胞（AN-V+/PI?）的数量分析结果：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §, ?)，P<0.0001。(E7) 晚期凋亡细胞（AN-V+/PI+）的数量分析结果：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §, ?)，P<0.0001。(F1–F5) 免疫荧光显微镜观察结果（400倍），显示细胞内Ca2+水平（绿色）。(F6) 细胞内Ca2+表达的平均荧光强度（即Fluo-4 AM染色）分析结果：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.0001。(G) 丙二醛（MDA）水平的分析结果：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.0001。所有统计分析均采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验（每组n=4）。符号(*, ?, ?, §)表示各组之间存在显著差异（显著性水平为0.05）。HBMDMSCsOve-DEC指的是在人类骨髓间充质干细胞中过表达decorin基因。

HBMDMSCsOve-DEC通过调节细胞应激信号通路、氧化应激生物标志物及抗氧化剂的蛋白表达来发挥作用。为评估HBMDMSCsOve-DEC处理对细胞应激信号通路的抑制作用，将L2细胞分为如图2所示的A1–A5组。西方印迹分析显示，MAPK信号通路中的关键分子——磷酸化p-ERK1/2、p-JNK和p-p38的蛋白表达水平在A1组最低，在A2组最高。值得注意的是，与A3组和A4组相比，A5组的这些蛋白表达水平显著降低，而A3组与A4组之间则无显著差异（见图3及补充数字内容图3，网址：https://links.Lww.Com/JS9/H555）。多媒体展示。图3. 多媒体展示。细胞应激信号通路、氧化应激、抗氧化剂以及DNA损伤生物标志物的蛋白表达情况。(A) p-ERK1/2的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(B) p-JNK的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(C) p-p38的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(D) NOX-1的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(E) NOX-2的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(F) NOX-4的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(G) p22phox的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(H) 氧化蛋白的表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。（注：上图左侧和右侧的条带分别代表蛋白分子量标记物和对照的氧化分子蛋白标准品。）M.W.表示分子量；DNP为1,3-二硝基苯肼。(I) superoxide dismutase 1（SOD1）的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(J) glutathione peroxidase 1（GPx）的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(K1–K5) 免疫荧光显微镜观察结果（400倍），用于检测γ-H2AX的细胞表达情况（粉色）。(K6) γ-H2AX的数量分析结果：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。所有统计分析均采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验（每组n=3–4）。符号(*, ?, ?, §)表示各组之间存在显著差异（显著性水平为0.05）。此外，作为氧化应激关键指标的NOX-1、NOX-2、NOX-4、p22phox以及OxyBlot的蛋白表达水平在所有组中都呈现出与MAPK信号通路生物标志物相似的趋势。同样，作为DNA损伤标志物的γ-H2AX的表达趋势也与MAPK相关蛋白一致。相比之下，两种主要抗氧化酶GPx和SOD的蛋白水平在各组中的变化趋势则与氧化应激标志物相反。总体而言，这些研究结果表明HBMDMSCsOve-DEC处理最有效地抑制了氧化应激，减轻了DNA损伤，并增强了细胞的抗氧化防御能力。

在博来霉素处理过程中，p22phox介导的细胞应激信号通路、上皮-间质转化以及炎症反应起着关键作用。为验证沉默Cyba基因是否能够缓解博来霉素引发的细胞应激信号通路、EMT及炎症反应，将L2细胞分为B1 H2O（溶剂组）、B2（siRNA阴性对照组）、B3 [L2细胞+博来霉素（1.5 μg/mL）]以及B4 [L2细胞+siRNA-Cyba+博来霉素（1.5 μg/mL）]四组。西方印迹分析显示，B4组的p22phox蛋白表达水平明显低于其他组，而B3组的该蛋白表达水平则明显高于B1组和B2组，B1组与B2组之间则无显著差异，这表明Cyba基因在L2细胞中已被成功沉默（见图4及补充数字内容图4，网址：https://links.Lww.Com/JS9/H555）。多媒体展示。图4. 多媒体展示。博来霉素处理过程中p22phox介导的细胞应激、EMT及炎症反应的关键作用。左侧面板（在siRNA-p22phox处理条件下）：(A1–A4) 免疫荧光染色后的显微镜观察结果（400倍），用于检测L2细胞中I型胶原的沉积情况（绿色）。(B1–B4) DAPI染色后的显微镜观察结果（400倍），用于识别细胞核（蓝色）。(C1–C4) 将A1–B4的图像合并后，用于识别表达I型胶原的L2细胞（绿蓝色）。右下角的刻度尺表示20微米。(D) I型胶原阳性细胞的数量分析结果：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(E1–E4) 基线状态下的伤口愈合过程，P>0.5。(F1–F4) 72小时时的伤口愈合过程。(G) 伤口愈合速率的分析结果：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(H) p22phox的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(I) p-ERK1/2的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(J) p-JNK的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(K) p-p38的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(L) NF-κB的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(M) Snail蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(N) Vimentin蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(O) Zeb1蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。右侧面板（在p22phox基因过表达条件下）：(A1–A4) 免疫荧光染色后的显微镜观察结果（400倍），用于检测L2细胞中I型胶原的沉积情况（绿色）。(B1–B4) DAPI染色后的显微镜观察结果（400倍），用于识别细胞核（蓝色）。(C1–C4) 将A1至B4的图像合并后，用于识别表达I型胶原的L2细胞（绿蓝色）。右下角的刻度尺表示20微米。(D) I型胶原阳性细胞的数量分析结果：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(E1–E4) 基线状态下的伤口愈合过程，P>0.5。(F1–F4) 72小时时的伤口愈合过程。(G) 伤口愈合速率的分析结果：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(H) p22phox的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(I) p-ERK1/2的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(J) p-JNK的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(K) p-p38的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(L) NF-κB的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(M) Snail蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(N) Vimentin蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。(O) Zeb1蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?)，P<0.001。所有统计分析均采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验（每组n=3–5）。符号(*, ?, ?, §)表示各组之间存在显著差异（显著性水平为0.05）。此外，作为细胞应激信号通路关键标志物的ERK1/2、JNK和p38，以及作为促炎因子的NF-κB，还有与EMT相关的Snail和vimentin蛋白，在B3组中的表达水平均显著高于其他组。B4组中的这些蛋白表达水平也显著高于B1组和B2组，而B1组与B2组之间则无显著差异。总体而言，这些研究结果表明，作为NADPH氧化酶亚基且是氧化应激关键调控因子的p22phox，在博来霉素引发的氧化应激、炎症反应以及EMT进展过程中起着至关重要的作用。

HBMDMSCsOve-DEC处理能有效抑制EMT标志物的表达。为明确HBMDMSCsOve-DEC在博来霉素刺激下能否抑制L2细胞中EMT生物标志物的表达，将L2细胞分为A1至A5组，分组方式与图2相同。西方印迹分析显示，与EMT相关的标志物如I型胶原、弹性蛋白、TGF-β、FSP1、p-Smad3、层粘连蛋白、Snail、Vimentin以及α-SMA在A1组中的表达水平最低，在A2组中最高，而A5组的这些蛋白表达水平则显著低于A3组和A4组，A3组与A4组之间则无显著差异（见图5及补充数字内容图5，网址：https://links.Lww.Com/JS9/H555）。相比之下，作为上皮细胞标志物的E-cadherin在各组中的表达趋势则与之相反。多媒体展示。图5. 多媒体展示。HBMDMSCsOve-DEC处理能有效抑制EMT生物标志物的表达。(A) I型胶原的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(B) 弹性蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(C) 转化生长因子TGF-β的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(D) FSP1的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(E) 磷酸化p-Smad3的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(F) 层粘连蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(G) Snail蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(H) Vimentin蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。(I) α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达水平：*与其他组相比，不同符号表示差异显著(?, ?, §)，P<0.001。所有统计分析均采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验（每组n=3）。符号（*、?、?、§）表示各组之间的显著性差异（在0.05水平上）。装饰素基因操作对L2细胞和HBMDMSCs的影响DO（DEC/IL-10）处理对L2细胞中EMT生物标志物表达的影响为验证装饰素基因操作在L2细胞中的效果以及HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）对EMT生物标志物的影响，将L2细胞分为C1（L2细胞）、C2 [L2细胞 + BLM（1.5 μg/mL）]、C3 [L2细胞Ove-DEC + BLM（1.5 μg/mL）]、C4 [转染针对装饰素的siRNA的L2细胞 + BLM（1.5 μg/mL）]、C5 [L2细胞 + BLM（1.5 μg/mL） + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）]以及C6 [L2细胞 + BLM（1.5 μg/mL） + 装饰素（100 nM）]。Western blot分析显示，层粘连蛋白、弹性蛋白、FSP-1、波形蛋白、Snail、I型胶原、α-SMA、TGF-βR、TGF-β、Zeb1、p-Smad2和p-Smad3（与EMT相关的标志物）在C1组中的表达水平最低，而在C2组和C4组中最高（见图6及补充数字内容图6，链接：https://links.Lww.Com/JS9/H555）。与C3组和C6组相比，C5组中这些标志物的表达水平显著降低，而C2组与C4组之间以及C3组与C6组之间则无显著差异。相反，E-钙粘蛋白在各组中的表达模式则相反。作为细胞周期关键调控因子的周期蛋白D和周期蛋白E，其表达模式也与EMT标志物相似。图6. 装饰素基因在L2细胞和HBMDMSCs DO（DEC/IL-10）中操作对调节L2细胞中EMT生物标志物表达的影响。(A) 层粘连蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(B) 弹性蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(C) 铁死亡抑制蛋白1（FSP-1）的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(D) 波形蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(E) Snail的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(F) I型胶原的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(G) α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(H) 转化生长因子β受体（TGF-βR）的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(I) TGF-β的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(J) Zeb1的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(K) 磷酸化的p-Smad2的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(L) p-Smad3的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(M) 周期蛋白D的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(N) 周期蛋白E的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(O) β-连环蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(P) Wnt蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(Q) c-Myc蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(R) Twist蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(S) E-钙粘蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(T) p22phox的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§、?），P< 0.0001。所有统计分析均采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验（每组n=3）。符号（*、?、?、§、?）表示各组之间的显著性差异（在0.05水平上）。CG1629细胞中的siRNA装饰素是指在CG1629细胞中沉默装饰素基因；HBMDMSCsDO（DEC-IL-10）是指在人类骨髓来源的间充质干细胞中同时过表达装饰素和白细胞介素（IL）-10。Wnt/β-连环蛋白信号通路是调控细胞增殖、分化和迁移的关键通路[63]。此外，由MAPK激活的Twist信号通路可促进EMT和细胞迁移，并有助于降低E-钙粘蛋白的表达[64–67]。原癌基因c-Myc也在调控细胞生长和增殖中起着核心作用。与这些功能一致，Wnt/β-连环蛋白、Twist和c-Myc的蛋白表达水平在各组中的变化趋势也与EMT标志物相似。为验证基因过表达的效果，将L2细胞分为四组：L2对照组、L2 + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）组、L2 + BLM（1.5 μg/mL）组以及L2 + BLM + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）组。通过qPCR、Western blotting、细胞存活率检测以及伤口愈合试验来评估其功能活性。qPCR分析显示，与对照组相比，HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）组中装饰素和IL-10的mRNA水平显著升高。相应地，24小时、48小时和72小时时的蛋白表达水平及细胞存活率在各组中也呈现类似趋势。72小时时，L2 + BLM组的伤口愈合能力最低，而L2 + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）组的伤口愈合能力最高，同时L2对照组组的伤口愈合能力也显著高于L2 + BLM + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）组。这些结果证实了在HBMDMSCs中实现基因过表达具有功能性作用。装饰素基因操作对CG1629细胞和HBMDMSCsDO(DEC/IL-10)中EMT生物标志物表达的影响为进一步验证装饰素基因的作用或HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）对EMT生物标志物的影响，我们使用了另一类细胞——CG1629细胞（即正常成纤维细胞），并将其分为D1（CG1629细胞）、D2 [CG1629细胞 + BLM（1.5 μg/mL）]、D3 [CG1629细胞Ove-DEC + BLM（1.5 μg/mL）]、D4 [在CG1629细胞中转染装饰素siRNA + BLM（1.5 μg/mL）]、D5 [CG1629细胞 + BLM（1.5 μg/mL） + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）]以及D6 [CG1629细胞 + BLM（1.5 μg/mL） + 装饰素（100 nM）]。Western blot分析显示，层粘连蛋白、弹性蛋白、FSP-1、波形蛋白、Snail、I型胶原、α-SMA、TGF-βR、TGF-β、Zeb1、p-Smad2和p-Smad3（与EMT相关的标志物）在D1组中的表达水平最低，而在D2组和D4组中最高（见图7）。与D3组和D6组相比，D5组中这些标志物的表达水平显著降低，而D2组与D4组之间以及D3组与D6组之间则无显著差异。相反，E-钙粘蛋白在各组中的表达模式则相反。周期蛋白D和周期蛋白E的表达模式也与EMT标志物相似。同样，Wnt、β-连环蛋白、Twist和c-Myc在各组中的表达趋势也较为接近。图7. 装饰素基因在CG1629细胞和HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）中操作对调节CG1629细胞中EMT生物标志物表达的影响。(A) 层粘连蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(B) 弹性蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(C) FSP-1的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(D) 波形蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(E) Snail的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(F) I型胶原的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(G) α-SMA的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(H) TGF-βR的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(I) TGF-β的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(J) Zeb1的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(K) p-Smad2的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(L) p-Smad3的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(M) 周期蛋白D的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(N) 周期蛋白E的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(O) β-连环蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(P) Wnt蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(Q) c-Myc蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(R) Twist蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(S) E-钙粘蛋白的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.001。(T) p22phox的蛋白表达：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§、?），P< 0.0001。所有统计分析均采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验（每组n=3）。符号（*、?、?、§、?）表示各组之间的显著性差异（在0.05水平上）。CG1629细胞中的siRNA装饰素是指在CG1629细胞中沉默装饰素基因；HBMDMSCsDO（DEC-IL-10）是指在人类骨髓来源的间充质干细胞中同时过表达装饰素和白细胞介素（IL）-10。经过博来霉素处理后第35天的动脉氧饱和度（%）、右心室收缩压、左心室收缩压、右心室重量与体重的比值以及全湿肺重量与胫骨长度的比值经过BLM处理后第7天，SC组的动脉氧饱和度（SaO2）显著高于PF组、PF + HBMDMSCs组以及PF + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）组，而后三组之间则无显著差异。到第35天时，SaO2在SC组仍为最高，而在PF组最低，且PF + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）组的SaO2显著高于PF + HBMDMSCs组（见图8）。图8. 经过博来霉素处理后第35天的动脉氧饱和度（SaO2）（%）、右心室收缩压（RVSBP）、股动脉收缩压（FASBP）、右心室重量与体重的比值以及全湿肺重量。(A) 第7天的动脉氧饱和度（SaO2）（%）：*与?相比，P< 0.001。(B) 第7天的动脉氧饱和度（SaO2）（%）：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.0001。(C) 右心室重量与胫骨长度的比值：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?），P< 0.001。(D) 全湿肺重量（WWLW）：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?），P< 0.001。(E) 右心室收缩压（RVSBP）：*与其他组相比，不同符号表示差异（?、?、§），P< 0.0001。(F) 左心室收缩压（LVSBP）：*与?相比，P< 0.001。所有统计分析均采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验（每组n=8–10）。符号（*、?、?、§）表示各组之间的显著性差异（在0.05水平上）。与其它所有组相比，PF组的右心室收缩压（RVSBP）显著升高。PF + HBMDMSCs组的RVSBP也高于SC组和PF + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）组，而PF + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）组的RVSBP则又高于SC组。右心室重量与胫骨长度的比值在SC组最低，而在PF组最高，虽然两组都与PF组相比有显著下降，但两者之间无差异。同样，全湿肺重量在SC组最低，而在PF组最高，两组的变化程度也相近。相比之下，SC组和PF + HBMDMSCs组的左心室收缩压低于PF组及PF + HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）组，各组内部则无显著差异。PF诱导后第35天的肺损伤评分、肺实变面积以及肺实质中的炎症细胞数量为了评估肺损伤和实变情况，进行了组织病理学检查。正如预期，与SC组相比，PF组的肺泡囊数量显著减少，而这种减少在加入HBMDMSCs后有所缓解，再加入HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）后则进一步改善。相反，肺实质的拥挤程度和实变区域在各组中则呈现出相反的趋势。在细胞层面，γ-H2AX表达（一种DNA损伤标志物）以及纤维化面积（通过Masson三色染色测定）的变化趋势也与肺损伤评分一致。总体而言，这些研究结果表明，在接受HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）治疗的PF模型动物中，肺损伤和纤维化得到了最有效的改善（见图9）。图9. PF诱导后第35天的肺损伤评分、肺实变面积以及肺实质中的炎症细胞数量。(A–D) 四组肺实质在显微镜下（400倍）观察时的组织病理学表现（即H.E.染色结果）。右下角的刻度尺表示50微米。(E)四组中肺泡囊的数量：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(F)肺实质的拥挤程度评分：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(G–J)400倍显微镜观察结果，用于识别肺纤维化区域（蓝色虚线）。右下角的刻度尺表示20微米。(K)纤维化区域的分析结果：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(L–O)400倍显微镜下免疫荧光染色结果，用于识别γ-H2AX的细胞表达情况（粉色）。右下角的刻度尺表示20微米。(P)γ-H2AX阳性细胞的分析结果：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(Q–T)400倍显微镜下免疫荧光染色结果，用于识别Treg细胞（红色）。右下角的刻度尺表示20微米。(U)阳性染色的Treg细胞数量的分析结果：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。所有统计分析均采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验（每组n=6–10）。符号(*)、?、″表示在0.05水平上具有显著性意义。

PF诱导后第35天肺实质中细胞应激信号蛋白的表达情况。为进一步评估HBMDMSCs及HBMDMSCsDO(DEC/IL-10)对BLM诱导的肺损伤的保护作用，进行了西方印迹分析。层粘连蛋白、弹性蛋白、波形蛋白、Snail、I型胶原、α-SMA、Zeb1以及p-Smad2（与EMT相关的标志物）在PF组中的表达水平最高，在PF+HBMDMSCs组中显著降低，而在PF+HBMDMSCsDO(DEC/IL-10)组中进一步降低，SC组的表达水平则始终最低（见图10）。相比之下，E-钙粘蛋白在各组中的表达模式则相反。同样，c-Myc、周期蛋白D、周期蛋白E、Wnt、β-连环蛋白以及Twist的表达模式也与EMT标志物一致，而装饰蛋白的表达模式则与Wnt/β-连环蛋白信号通路相反。图10为相关内容的多媒体展示。

PF诱导后第35天肺实质中细胞应激信号蛋白的表达情况。(A)层粘连蛋白的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(B)弹性蛋白的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(C)波形蛋白的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(D)Snail的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(E)I型胶原的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(F)α-SMA的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(G)Zeb1的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(H)磷酸化p-Smad2的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(I)E-钙粘蛋白的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(J)c-Myc的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(K)周期蛋白D的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(L)周期蛋白E的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(M)Wnt信号的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(N)β-连环蛋白的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(O)Twist信号的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(P)装饰蛋白的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(Q)TGF-β的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(R)p-Smad3的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(S)p22phox的蛋白表达：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(T)OxyBlot蛋白氧化表达情况：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.001。（注：上图中的左右两道带分别代表蛋白分子量标记物和对照氧化分子蛋白标准品）。M.W.表示分子量；DNP为1-3二硝基苯肼。所有统计分析均采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验（每组n=6）。符号(*)、?、″表示在0.05水平上具有显著性意义。

此外，TGF-β和p-Smad3（TGF-β/Smad3纤维化信号通路的标志物），以及p22phox和OxyBlot（氧化应激的指标），在各组中的表达模式与Wnt/β-连环蛋白信号通路类似。

BLM诱导的肺纤维化发生后7天和35天，循环系统中炎症细胞和免疫细胞的动态变化。PF诱导后第7天，血浆中CD11b/c?和Ly6G?细胞（炎症细胞群）的水平在PF组明显高于SC组。同样，外周血单核细胞中CD3?/CD4?辅助性T细胞、CD3?/CD8?细胞毒性T细胞以及CD4?CD25?Foxp3?调节性T细胞的比例在PF组也高于SC组。到第35天时，CD11b/c?和Ly6G?细胞的数量在PF组仍为最高，SC组最低，而PF+HBMDMSCsDO(DEC/IL-10)组中的这些细胞数量则比PF+HBMDMSCs组显著减少（见图11）。相比之下，CD3?/CD4?和CD3?/CD8? T细胞的比例在各组之间差异不大。调节性T细胞也呈现出相似的趋势，表明PF环境中的炎症刺激会引发协调一致的免疫反应。图11为相关内容的多媒体展示。

BLM诱导的肺纤维化发生后7天和35天，循环系统中炎症细胞和免疫细胞的动态变化。(A1和A2)展示用于识别CD11b/c?细胞的流式细胞术分析过程（即FSC/SSC门控技术）。(A3)第7天时循环系统中CD11b/c?细胞的比例：*与?相比，P<0.0001。(B1和B2)展示用于识别Ly6G?细胞的流式细胞术分析过程（即FSC/SSC门控技术）。(B3)第7天时循环系统中Ly6G?细胞的比例：*与?相比，P<0.0001。(C1和C2)展示用于识别CD3+/CD4+辅助性T细胞的流式细胞术分析过程（即FSC/SSC门控技术）。(C3)第7天时CD3+/CD4+辅助性T细胞的数量：*与?相比，P<0.0001。(D1和D2)展示用于识别CD3+/CD8?细胞毒性T细胞的流式细胞术分析过程（即FSC/SSC门控技术）。(D3)第7天时CD3+/CD8?细胞毒性T细胞的数量：*与?相比，P<0.0001。(E1和E2)展示用于识别CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的流式细胞术分析过程（即FSC/SSC门控技术）。(E3)第7天时CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的数量：*与?相比，P<0.0001。(F1–F4)展示用于识别CD11b/c?细胞的流式细胞术分析过程（即FSC/SSC门控技术）。(F5)第35天时循环系统中CD11b/c?细胞的比例：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(G1–G4)展示用于识别Ly6G?细胞的流式细胞术分析过程（即FSC/SSC门控技术）。(G5)第35天时循环系统中Ly6G?细胞的比例：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(H1–H4)展示用于识别CD3+/CD4+辅助性T细胞的流式细胞术分析过程（即FSC/SSC门控技术）。(H5)第35天时CD3+/CD4+辅助性T细胞的数量：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(I1–I4)展示用于识别CD3+/CD8?细胞毒性T细胞的流式细胞术分析过程（即FSC/SSC门控技术）。(I)第35天时CD3+/CD8?细胞毒性T细胞的数量：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。(J1–J4)展示用于识别CD4+CD25+127-调节性T细胞的流式细胞术分析过程（即FSC/SSC门控技术）。(J)第35天时CD4+CD25+127-调节性T细胞的数量：*与其他组用不同符号表示(?, ?, §)，P<0.0001。所有统计分析均采用单因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验（每组n=6–10）。符号(*)、?、″表示在0.05水平上具有显著性意义。与先前的研究结果一致，即Wnt/β-catenin信号通路可增强c-Myc表达，从而促进细胞增殖[75]，我们的研究也表明该通路通过促进细胞外基质生成和EMT过程在肺纤维化中发挥作用[75]。其次，主要由MAPK家族介导的细胞应激信号在肺纤维化中显著升高。第三，氧化应激信号也明显被激活。第四，TGF-β/p-Smad3信号通路则是另一种起作用的路径。总体而言，这些研究结果表明，肺纤维化的进展是由多种信号通路的协同激活所驱动的，而非单一主导通路，而这些通路又共同促进了EMT的启动及疾病的进展（见图形摘要）。读者可能对三个关键问题感兴趣。首先，我们发现了一个能够调控四大下游信号通路的中心调控点。我们的研究显示，NADPH氧化酶的亚基p22phox是一种关键的调控分子，它能够调控Wnt/β-catenin、细胞应激、氧化应激以及TGF-β/p-Smad3信号通路，同时还与炎症反应和EMT的进展相关（见图形摘要）。其次，我们研究了decorin和IL-10在调控多种信号通路中的协同作用。基于大量的体外和体内实验证据，我们认为它们在减轻肺纤维化方面的治疗效果主要源于对两个关键信号瓶颈的协同抑制：氧化应激和TGF-β/p-Smad3信号轴，具体如图形摘要所示。尽管这种协同作用的精确分子机制仍有待进一步阐明，但我们的功能数据表明，同时过表达decorin和IL-10能够对上游的炎症和氧化应激通路以及下游的TGF-β/Smad3信号通路产生互补的多层次抑制作用，从而提升治疗效果。最后，我们探讨了这些临床前研究结果在肺纤维化患者中的应用潜力。虽然研究结果令人鼓舞，但经过基因改造以过表达decorin和IL-10的HBMDMSCs在临床应用时面临着重大的伦理和监管挑战，这些因素目前限制了其直接用于临床治疗。我们之前的研究表明，异种MSC疗法能够安全有效地保护糖尿病肾病患者残余的肾功能[76]，同时还能保护肺部免受急性缺血-再灌注损伤[49]。与这些研究结果一致，本研究表明，异种HBMDMSCs治疗肺纤维化小鼠也能取得类似的治疗效果[49,76]。重要的是，即使反复给予HBMDMSCs或HBMDMSCsDO（DEC/IL-10），也未观察到任何与排斥反应相关的不良效应，这表明异种MSC具有内在的免疫豁免特性。尽管在本鼠模型中使用了五次静脉注射MSC衍生产品，但我们承认这种重复给药方案并不能直接反映当前IPF的临床治疗实践，因为在早期试验中通常只进行一两次输注即可。我们的目的并非复制临床治疗方案，而是为了在BLM诱导的肺损伤活跃期提供持续的抗炎和抗纤维化作用。从建模的角度来看，BLM会在数周内引发从急性到亚急性的损伤过程，而人类IPF则是一种慢性、异质性较强的疾病，其进展较为缓慢。因此，我们的多剂量给药策略应被视为一种用于评估在持续纤维化信号作用下的损伤修复情况及疗效的工具，而非对长期临床治疗的直接模拟。重要的是，这种设计使我们能够评估活跃期纤维化过程中的累积治疗效果以及基因改造带来的协同效应。不过，我们也认为，未来的转化研究应当探讨降低剂量方案以及慢性期或延迟治疗模型，以便更好地反映IPF的临床实际情况。目前，吡非尼酮和尼达尼布等抗纤维化药物是IPF的标准药物治疗手段[12,77–79]。这些药物主要通过针对关键的纤维化生成通路来延缓疾病进展[12,77–79]，包括TGF-β信号通路以及酪氨酸激酶介导的通路；然而，正如大规模III期临床试验所显示的那样，这类药物的临床益处主要限于延缓功能衰退，而无法逆转已形成的纤维化[12,77–79]。相比之下，本研究探讨了一种基于基因改造MSC的细胞疗法策略，该策略能够同时针对多种致病过程，包括氧化应激、炎症反应以及TGF-β/Smad3信号通路。值得注意的是，同时过表达decorin和IL-10可能比传统的单靶点药物治疗带来更广泛、更全面的抗纤维化效果。尽管这些研究结果显示出相较于现有治疗方法的潜在优势，但仍需进一步的研究来直接比较这两种疗法的治疗效果、安全性以及长期预后，同时还要评估其临床应用的可行性。研究局限性本研究存在若干局限性。首先，虽然研究结果令人期待，但观察时间仅为35天，因此HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）的长期效果尚不清楚。其次，用于在啮齿动物中诱发肺纤维化的BLM最佳剂量并未经过系统评估。第三，需要说明的是，L2和CG1629细胞实验的目的是为了研究包括TGF-β/p-Smad2/3信号通路、氧化应激、EMT以及细胞凋亡在内的关键机制通路，并非旨在完全模拟BLM诱导的肺纤维化的复杂体内病理过程。第四，本研究中仅使用了雄性小鼠。虽然这种方法确保了与以往BLM诱导肺纤维化模型的一致性，但我们知道性别差异可能会影响肺纤维化的易感性和进展程度。第五，图形摘要旨在将我们的研究结果与现有文献相结合，形成一种概念框架，而非经过完全验证的信号网络。第六，我们并未独立重新评估经过decorin/IL-10修饰后的三系分化情况。不过，作为母本的HBMDMSCs符合ISCT标准，而且先前的研究表明，类似的基因修饰并不会影响其分化能力。最后，尽管研究了多次给予基因改造MSC的效果，但本体内研究中并未评估单独过表达decorin或IL-10的MSC多次给药的效果。总之，肺纤维化的治疗仍然是一个重大的临床难题。本研究表明，HBMDMSCsDO（DEC/IL-10）能够有效缓解BLM诱导的肺纤维化。这些研究结果为这种基于基因改造MSC的疗法在未来临床应用中的潜力提供了支持，尤其是对于那些对传统疗法无反应的肺纤维化及肺动脉高压患者。伦理审批所有动物实验程序均获得了台湾高雄市苗栗区大埔路123号高雄长庚纪念医院机构动物护理与使用委员会的批准（动物使用方案批准函编号：IACUC No. 2023032304），并且所有实验都是按照《实验室动物护理和使用指南》第八版（美国国立卫生研究院出版物编号85-23，美国华盛顿特区国家科学院出版社，2011年修订版）的要求进行的。